Metody detekcji i identyfikacji bakterii Dorota Żabicka Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowy Instytut Leków Warszawa

Budowa komórki bakteryjnej

Badanie mikrobiologiczne Cel: identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia i oznaczenie wrażliwości na antybiotyki Tok badania mikrobiologicznego Pobranie materiału Badanie materiału: Metody klasyczne Badanie mikroskopowe Hodowla i identyfikacja drobnoustroju Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki Metody immunologiczne Metody molekularne

Pobieranie i przesyłanie materiału Rodzaj podłoża transportowego i rodzaj pojemników są dostosowywane do rodzaju materiału i kierunku badania (bakterie, wirusy, obecność przeciwciał)

Badanie mikroskopowe Mikroskop świetlny Preparaty barwione metoda Grama metody specjalne np. barwienie na obecność zarodników Laseczka tężca Clostridium tetani, zarodniki na końcu komórki bakteryjnej nadające kształt pałeczki dobosza

Ściana komórkowa bakterii Bakterie Gram-dodatnie Bakterie Gram-ujemne

Badanie mikroskopowe Neisseria meningitidis Preparat z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego barwiony metodą Grama Cryptococcus neoformans Preparat tuszowy z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego

Badanie mikroskopowe Preparat z ciemnym polem widzenia (Treponema pallidum) Mikroskop fluorescencyjny

Badanie mikroskopowe Mikroskop kontrastowo-fazowy grzyby z rodzaju Candida

Badanie mikroskopowe Mikroskop elektronowy

Hodowla bakterii Stosowane podłoża bakteriologiczne płynne i stałe Hodowla prowadzona w warunkach najbardziej odpowiednich dla poszukiwanych drobnoustrojów Czas hodowli od kilku godzin (np. pałeczki okrężnicy czyli Escherichia coli) do kilkunastu dni (np. prątki gruźlicy czyli Mycobacterium tuberculosis)

Wymagania wzrostowe bakterii Zapotrzebowanie na tlen Tlenowe – O2 Beztlenowe – mniej niż 1-0,5% O2 Mikroaerofilne – mieszanina 5% O2, 10% CO2, 85% N2 Źródło węgla Autotroficzne – CO2 Heterotroficzne – aminokwasy, peptydy, cukry, lipidy Pozostałe związki niezbędne do wzrostu Sole nieorganiczne Witaminy

Czynniki fizykochemiczne Temperatura Psychrofile – optimum 0-10C Mezofile – optimum 20-40C Termofile – optimum 50-60C pH Większość bakterii preferuje neutralne wartości pH ~ 7.0 Ciśnienie osmotyczne Wiekszość preferuje aw ~ 0,99

Wzrost hodowli bakterii w podłożu płynnym

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Podłoże agarowe wzbogacone krwią – widoczna strefa hemolizy dookoła kolonii

Hodowla i wstępna identyfikacja drobnoustrojów CPS Podłoża wybiórcze, wybórczo-różnicujące chromogenne i specjalne MacConkey agar

Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki – podłoża chromogenne MRSA ESBL VRE

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem testów wykonywanych na płytkach wrażliwość na bacytracynę test CAMP

Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem zestawów probówkowych gotowych testów identyfikacyjnych

Systemy automatyczne Systemy automatyczne stosowane są do hodowli drobnoustrojów (np. Bactec do posiewów krwi) lub do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych drobnoustrojów VITEK 2 Compact BioMerieux Phoenix BD Diagnostic Systems

System VITEK 2 Compact System automatyczny do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości drobnoustrojów wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych

Oznaczenie lekowrażliwości drobnoustrojów Oznaczanie metodą rozcieńczeniową Gotowe testy diagnostyczne do odczytu manualnego Oznaczanie za pomocą systemów automatycznych

Oznaczanie lekowrażliwości i mechanizmów oporności na antybiotyki Dyfuzja z paska Dyfuzja z krążka Szczep gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) oporny na wszystkie antybiotyki -laktamowe (MRSA) Podłoże z antybiotykiem

Metody immunologiczne Testy lateksowe, ELISA, immunofluorescencyjne wykrywające całe komórki lub antygeny bakterii (białka powierzchniowe, wielocukry otoczkowe, toksyny) Pozwalają wykryć bakterie w materiale pobranym od chorego lub pomagają w identyfikacji wyhodowanych bakterii Stosowane gotowe testy manualne lub automatyczne Aglutynacja lateksowa

Metody immunologiczne - EIA

Metody immunologiczne – systemy automatyczne System VIDAS

Nowe metody oparte o metody immunologiczne

Spektrometria MALDI-TOF

Spektrometria MALDI-TOF

Spektrometria MALDI-TOF

Metody molekularne Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub real-time PCR Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch wariantach Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja w dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR Zestawy odczynników lub zamknięte systemy diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie określonej firmy Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M.tuberculosis jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych

Genom bakteryjny Chromosom bakteryjny o różnej wielkości w zależności od gatunku bakterii oraz obecności wbudowanych elementów ruchomych (plazmidów, transpozonów, bakteriofagów)

Metoda PCR

Metoda PCR 6 1 8 / 9 7 5 A T C 4 3 2 R u l e r DNA mecA ok. 550 kb 1 8 / 9 7 5 A T C 4 3 2 R u l e r DNA mecA ok. 550 kb mecA gen występujący u MRSA

Real-time PCR Krzywe reakcji real-time PCR

Szybkie testy molekularne np. GeneXpert

Sondy typu Scorpion Dwa rodzaje sond typu Scorpion stosowane w testach z serii GeneXpert rysunki: źródło Cepheid

Zintegrowana kontrola wewnętrzna w mieszaninie reakcyjnej Mg2+ Taq DNA Polymerase target scorpion IC scorpion dCTP dGTP Internal Control (IC) dUTP dATP rysunki źródło Cepheid

Mikromacierze

Bakteriofagi – wirusy bakteryjne

Bakteriofagi - morfologia

Bakteriofagi – cykle życiowe

Bakteriofagi – zastosowanie w diagnostyce Typowanie bakterii w celu określenia pokrewieństwa izolowanych szczepów łysinka

Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii

Dziękuję za uwagę