Struktura i ewolucja genomów roślinnych

Liczba chromosomów Metody ustalania: analiza w mikroskopie świetlnym gniecionych preparatów komórek. Rośliny nasienne: od 2n=4 (np. Haplopappus gracilis) USA do 2n=ok.600 (Voanioala gerardii) Madagaskar

Rozmiar genomów Metody ustalania: Kinetyka reasocjacji DNA; Pomiary objętości jądra komórkowego; Oceny na podstawie próbek klonów z bibliotek genomowych; Mikrodesytometria jąder po barwieniu odcz. Feulgena; Cytometria przepływowa izolowanych jąder po barwieniu jodkiem propidyny. Na podstawie analiz >2800 gatunków roślin nasiennych: Haploidalny genom od 0.1 pg do125 pg. Ok. 50% roślin kwiatowych: 0.1 – 3.5 pg. Arabidopsis 125 Mb DNA – Fritillaria assyriaca – 120 000 Mb. (Szachownica lisia) Różnice także miedzy gatunkami z jednej rodziny: np. Poaceae (Wiechlinowate, d. trawy) :450 Mb (ryż), 750 Mb (sorgo), 2500 Mb (kukurydza), 5000 Mb (jęczmień), 16 000Mb (pszenica)

Rozmiar genomów i podstawowa liczba chromosomów u wybranych okryto- i nagonasiennych Cui et al.. Genome Res. 2006. 16: 738-749

Poliploidy - wnioski na podstawie analizy kariotypów 50-70% roślin kwiatowych przeszło podwojenie liczby chromosomów co najmniej raz w swojej historii ewolucyjnej. Poliploidy częste wśród roślin użytkowych: pszenica, rzepak, ziemniak, bawełna. Autopoliploidy (ten sam gatunek) i allopolipolidy (hybrydy miedzygat.)

Poliploidyzacja jest ważnym mechanizmem generowania nowych gatunków roślin. Powoduje, że niektóre gatunki mają zadziwiająco wysoką liczbę chromosmów. Gnieciony preparat chromosomów heksaplidalnego (6 kopii genomowych) gatunku paproci z rodzaju Cystopteris. Ten gatunek ma 126 par chromosomów. Aut. Michael Windham

Paradoks wartości C i jego przyczyny Genomy eukariotyczne mają bardzo różne rozmiary, co nie ma związku ze stopniem złożoności organizmu. Różnice w wielkości genomów wynikają przede wszystkim z różnic w poliploidalności i w zawartości niekodującego DNA, w szczególności transpozonów (TEs). Poliploidyzacja i akumulacja elementów transpozonowych to główne siły napędowe ekspansji genomów roślinnych. Główne mechanizmy utraty DNA to nierównomierny ‘crossing-over’, i nieuprawniona rekombinacja – przeciwdziałają one nieograniczonej ekspansji genomów. W ewolucji roślin obserwuje się faworyzowanie większych genomów. Poliploidyzacja: przystosowawczo neutralna? (Wood, T. et al.. PNAS 2009)

WEWNĘTRZNA STRUKTURA GENOMÓW Paralogia – bliskie podobieństwo nie allelicznych segmentów chromosomów lub sekwencji DNA w obrębie gatunku, wskazuje na bliskie pokrewieństwo ewolucyjne. Paralogami są np. dwa różne ludzkie geny α-globinowe. Ortologia – bliskie podobieństwo segmentów chromosomów lub sekwencji DNA pomiędzy gatunkami. Ortologami są np. główny ludzki gen determinujący płeć SRY i jego odpowiednik (ortolog) u myszy – gen Sry. Homologia – ogólny termin określający podobieństwa sekwencji wskazujące na wspólne pochodzenie ewolucyjne (wewnątrz- lub pomiędzy gatunkami).

Kinetyka reasocjacji DNA DNA cięty na odcinki ok. 300 pz, denaturowany, następnie inkubowany w różnych stężeniach w ciągu różnych okresów czasu. Analiza - pomiar niezreasocjowanego (jednoniciowego) DNA (chromatografia na hydroksyapatycie) C0 – stężenie jednoniciowego DNA ( w molach nukleotydów/litr) na początku reakcji, t – czas reasocjacji w sekundach

Złożoność sekwencyjna genomów roślinnych na podstawie analizy kinetyk reasocjacji Złożone z sekwencji powtarzalnych i jednokopijnych Różnice w rozmiarach genomów głównie z powodu różnej ilości sekwencji powtarzalnych (istotny także poziom ploidalności). Podział sekwencji powtarzalnych: a) ułożone tandemowe (większość w centromerach, telomerach) i b) rozrzucone po genomie. W klasie b) najczęściej transpozony. W Arabidopsis stanowią ok.10% genomu, w kukurydzy - 50%

Organizacja centromerów w Arabidopsis

Rodzaje sekwencji w genomach roślin elementy transpozonowe: (na przykładzie Arabidopsis) - copia- i gypsy-like long terminal repeat (LTR) retrotransposons, long interspersed nuclear elements (LINEs); short interspersed nuclear elements (SINEs), hobo/Activator /Tam3 (hAT)-like elements, CACTA-like elements miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs).

Model obszarów genowych w genomach roślin Strzałki = geny (eksony zaznaczone na czarno) MITE =miniature inverted transposable elements LTR = long terminal repeat SSR = simple sequence repeat

Struktura chromosomów Arabidopsis - duplikacje

Rodzaje duplikacji w Arabidopsis

Relacje między gatunkowe/syntenia Syntenia = podobieństwo genów i ich ułożenia w chromosomach

Porównanie rejonów ortologicznych obszaru adh w genomach sorgo i kukurydzy (zacienienia= silne podobieństwo sekwencji)

Syntenia: Arabidopsis/ryż

Genome sequencing and analysis of the model grass Brachypodium distachyon The International Brachypodium Initiative* The International Brachypodium Initiative Principal investigators John P. Vogel1, David F. Garvin2, Todd C. Mockler3, Jeremy Schmutz4, Dan Rokhsar5,6, Michael W. Bevan7; DNA sequencing and assembly Kerrie Barry5, Susan Lucas5, Miranda Harmon-Smith5, Kathleen Lail5, Hope Tice5, Jeremy Schmutz4 (Leader), Jane Grimwood4, Neil McKenzie7, Michael W. Bevan7; Pseudomolecule assembly andBACend sequencingNaxinHuo1, Yong Q.Gu1,GerardR. Lazo1, OlinD.Anderson1, John P. Vogel1 (Leader), Frank M. You8,Ming-Cheng Luo8, Jan Dvorak8, Jonathan Wright7, Melanie Febrer7, Michael W. Bevan7, Dominika Idziak9, Robert Hasterok9, David F. Garvin2; Transcriptome sequencing and analysis Erika Lindquist5, Mei Wang5, Samuel E. Fox3, Henry D. Priest3, Sergei A. Filichkin3, Scott A. Givan3, Douglas W. Bryant3, JeffH.Chang3, ToddC.Mockler3 (Leader), HaiyanWu10,24, Wei Wu10, An-Ping Hsia10, Patrick S. Schnable10,24, Anantharaman Kalyanaraman11, Brad Barbazuk12, Todd P.Michael13, Samuel P.Hazen14, JenniferN. Bragg1, Debbie Laudencia-Chingcuanco1, John P. Vogel1, David F. Garvin2, Yiqun Weng15, Neil McKenzie7, Michael W. Bevan7; Gene analysis and annotation Georg Haberer16, Manuel Spannagl16, Klaus Mayer16 (Leader), Thomas Rattei17, ThereseMitros6, Dan Rokhsar6, Sang-Jik Lee18, Jocelyn K. C. Rose18, Lukas A. Mueller19, Thomas L. York19; Repeats analysis Thomas Wicker20 (Leader), Jan P. Buchmann20, Jaakko Tanskanen21, Alan H. Schulman21 (Leader), Heidrun Gundlach16, Jonathan Wright7, Michael Bevan7, Antonio Costa de Oliveira22, Luciano da C. Maia22, William Belknap1, Yong Q. Gu1, Ning Jiang23, Jinsheng Lai24, Liucun Zhu25, JianxinMa25, Cheng Sun26, Ellen Pritham26; Comparative genomics Jerome Salse27 (Leader), Florent Murat27, Michael Abrouk27, Georg Haberer16, Manuel Spannagl16, Klaus Mayer16, Remy Bruggmann13, Joachim Messing13, Frank M. You8, Ming-Cheng Luo8, Jan Dvorak8; Small RNA analysis Noah Fahlgren3, Samuel E. Fox3, Christopher M. Sullivan3, Todd C. Mockler3, James C. Carrington3, Elisabeth J. Chapman3,28, Greg D.May29, Jixian Zhai30, Matthias Ganssmann30, Sai Guna Ranjan Gurazada30, Marcelo German30, Blake C. Meyers30, Pamela J. Green30 (Leader); Manual annotation and gene family analysis Jennifer N. Bragg1, Ludmila Tyler1,6, Jiajie Wu1,8, Yong Q. Gu1, Gerard R. Lazo1, Debbie Laudencia-Chingcuanco1, James Thomson1, John P. Vogel1 (Leader), Samuel P. Hazen14, Shan Chen14, Henrik V. Scheller31, JesperHarholt32, Peter Ulvskov32, Samuel E. Fox3, Sergei A. Filichkin3, Noah Fahlgren3, Jeffrey A. Kimbrel3, Jeff H. Chang3, Christopher M. Sullivan3, Elisabeth J. Chapman3,27, James C. Carrington3, Todd C. Mockler3, Laura E. Bartley8,31, Peijian Cao8,31, Ki-Hong Jung8,31{, Manoj K Sharma8,31, Miguel Vega-Sanchez8,31, Pamela Ronald8,31, Christopher D.Dardick33, StefanieDe Bodt34,Wim Verelst34, Dirk Inze´34, Maren Heese35, Arp Schnittger35, Xiaohan Yang36, Udaya C. Kalluri36, GeraldA. Tuskan36, ZhihuaHua37, Richard D. Vierstra37, David F. Garvin3, Yu Cui24, Shuhong Ouyang24, Qixin Sun24, Zhiyong Liu24, Alper Yilmaz38, Erich Grotewold38, Richard Sibout39, Kian Hematy39, Gregory Mouille39, Herman Ho¨fte39, Todd Michael13, Je´rome Pelloux40, Devin O’Connor41, James Schnable41, Scott Rowe41, Frank Harmon41, Cynthia L. Cass42, John C. Sedbrook42, Mary E. Byrne7, SeanWalsh7, Janet Higgins7, Michael Bevan7, PinghuaLi19, ThomasBrutnell19, TurgayUnver43,Hikmet Budak43, Harry Belcram44, Mathieu Charles44, Boulos Chalhoub44, Ivan Baxter45 NATURE| Vol 463| 11 February 2010 ARTICLES 767 JP Vogel et al. Nature 463, 763-768 (2010) doi:10.1038/nature08747 Kłosownica leśna

Problem badania genomów traw użytkowych Trawy (Poaceae – ponad 600 rodzajów obejmujących ponad 10 000 gatunków, dominują w wielu systemach ekologicznych i rolniczych) dostarczają podstawowej masy żywności dla ludności Ziemi. Wysoce produktywne trawy są także poważnym źródłem odnawialnej energii Trzy podrodziny traw: Ehrartoideae (ryż), Panicoideae (kurkurydza, sorgo, trzcina cukrowa) i Pooideae (zboża stefy chłodnej, np. pszenica) – zawierają główne rośliny uprawne na Ziemi. Sekwencje genomów ryżu, kukurydzy, sorgo zostały ustalone – porównania wykazały silna konserwatywność liniowego porządku genów a także odległe i niedawne wydarzenia poliploidyzacyjne. Genomy większości użytkowych traw z podrodziny Pooideae są zbyt wielkie i skomplikowane, by nadawały się do szybkiego sekwencjonowania. Np.. Genom pszenicy (17 000 Mb) zawiera aż trzy niezależne genomy. Brachypodium (Pooideae; Kłosownica leśna) – diploid, jest dziką jednoroczną trawą z okolic Morza Śródziemnego i Bliskiego Wschodu, o niedużym genomie. Stanowi doskonały model do badania pszenicy i innych zbóż strefy chłodnej.,

Główne cechy genomu Brachypodium – rozkład w chromosomach JP Vogel et al. Nature 463, 763-768 (2010) doi:10.1038/nature08747

Identyfikacja transkryptów i genów; rozkład u trzech gatunków traw JP Vogel et al. Nature 463, 763-768 (2010) doi:10.1038/nature08747

Porównanie genomów trzech różnych traw Pokrewieństwa ewolucyjne pomiędzy Brachypodium, sorgo i ryżem oceniono mierząc średnią szybkość podstawień synonimicznych (Ks) w parach genów ortologicznych. Na tej podstawie ustalono, że Brachypodium dzieli 32-39 MYR (millions of years) od pszenicy, 40-53 MYR od ryżu i 45-60 MYR od sorgo. Paralogie między chromosomami Brachypodium wskazują, że w przeszłości nastąpiło 6 głównych duplikacji chromosomowych obejmujących 92,1% genomu. Pokrewieństwa ortologiczne są zgodne z modelem ewolucyjnym, według którego 5 chromosomów Brachypodium powstało z 5-chromosomowego genomu pierwotnego poprzez stadium 12-chromosomowe i obejmowało 7 głównych fuzji chromosomowych.

JP Vogel et al. Nature 463, 763-768 (2010) doi:10.1038/nature08747 Ewolucja genomu Brachypodium i syntenia pomiędzy trzema podrodzinami traw. JP Vogel et al. Nature 463, 763-768 (2010) doi:10.1038/nature08747

Powtarzający się wzór fuzji chromosomowych u traw Pięć chromosomów Brachypodium pokolorowano wg. kolorów odpowiadających homologiom z 12-ma chromosomami ryżu. Czerwona linia nad chromosomami – gęstość genów Główne nieciągłości w gęstości genów (czarne romby) wskazują punkty rozdzielające obszary synteniczne Białe romby – miejsca fuzji zawierajace pozostałości powtórzeń centromerowych b. Wzór zagnieżdżonych insercji całych chromosomów w rejony centromerowe wyjaśniający obserwowane rozdzielenia obszarów syntenii c., d. Przykłady zagnieżdżonych insercji chromosomowych u sorgo i jęczmienia

Powtarzający się wzór fuzji chromosomowych u traw. JP Vogel et al. Nature 463, 763-768 (2010) doi:10.1038/nature08747

Znacznie badań porównawczych genomów traw użytkowych Zrozumienie mechanizmu dywersyfikacji traw poprzez wytłumaczenie, jak zróżnicowanie liczby chromosomów u różnych rodzajów ewoluowało z pierwotnego zbioru 5 chromosomów poprzez zagnieżdżone w centromerach insercje całych chromosomów. Cel: Inżynieriach genomów traw w celu poprawy wydajności i jakości zbiorów (żywność i paliwa).

Genomy organelli komórkowych

Założenia teorii endosymbiotycznej Mitochondria eukariontów ewoluowały z bakterii tlenowych żyjących, jako symbionty, w komórkach pra-eukariotycznego gospodarza. Chloroplasty eukariontów ewoluowały z endosymbiotycznych sinic. Dowody: Mitochondria i chloroplasty powstają wyłącznie z istniejących mitochodriów i chloroplastów. mitochondria and chloroplasts. Nie mogą powstać w komórce, która nie zawiera tych organelli ponieważ geny jądrowe kodują tylko niektóre białka organellarne. Zarówno mitochondria jak i chloroplasty mają własne genomy, które przypominaja genomy bakterii, a nie genomy jądrowe: Oba składają się z kolistej cząsteczki DNA. Z DNA organelli nie są zasocjowane histony. Zarówno mitochondria jak i chloroplasty mają własny system translacji, który przypomina system prokariotyczny, a nie eukariotyczny. Pierwszym aminokwasem w transkryptach jest fMet jak u bakterii (a nie metionina [Met], która jest pierwszym aminokwasem w białkach eukariotycznych). Antybiotyki (np., streptomycyna) hamujace biosynteze białka u bakterii (lecz nie u eukarintów), hamuja także biiosyntezę białka w organellach. Inhibitory translacji eukariotycznej (np.. Toksyna dyfterytu) nie hamuja translacji w organellach. Antybiotyk rifampicina, który wybiórczo hamuje RNA polimrazę u bakterii, hamuje także RNA polimertqazę w organellach. ,

NCBI Organelle Genomes section at NCBI. L. Cui, N. Veeraraghavan, A.Richter, K. Wall, R. K. Jansen, J. Leebens-Mack, I. Makalowska, and C. W. dePamphilis. ChloroplastDB: the chloroplast genome database. Nucleic Acids Research, 2006, vol. 34, pp. D692-696.

Chloroplasty w roślinach Błony tylakoidów Światło błony tylakoidu Stroma – enzymy wiązania CO2 biosyntezy aminokwasów, metabolizmu lipidów. Błony tylakoidów – białka reakcji świetlnych fotosyntezy. Chromosomy koliste, przypominają bakteryjne, leżą w stromie DNA: dwuniciowy, kolisty 120-160 kB. Grana Stroma Błona wewnętrzna The dePamphilis Lab, Department of Biology, Penn State University Błona zewnętrzna

Chloroplast izolowany z liści szpinaku otoczka Błona tylakoidu stroma From Hoober 32

Rozmnażanie przez podział all plant and eukaryotic algal cells have plastids chloroplasts form by division; semi-autonomous Involves proteins (Fts) similar to those that mediate cell division in bacteria Cyanidioschyzon chloroplast dividing From Miyagishima et al. 33

Genomy chloroplastowe w roślinie Komórka miękiszu liścia – ok.100 chloroplastów. Liczba kopii DNA/chloroplast – 100 (młody liść) – 20-30 (stary liść). Pojedyncza komórka zawiera od 500 do 1000 kopii chromosomu chloroplastowego (10-20% całkowitego DNA).

Organizacja genomu chloroplastowego glonu Nephroselmis -typowa organizacja u roślin lądowych IR – odwrócone powtórzenia. SSC – krótki fragment jednokopijny. LSC – długi fragment jednokopijny. Geny wewnątrz mapy są transkrybowane w przeciwnym kierunku niż geny na zewnątrz mapy. Turmel, M., C. Otis, and C. Lemieux. 1999. The complete chloroplast DNA sequence of the green alga Nephroselmis olivacea: Insights into the architecture of ancestral chloroplast genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 10248-10253

Genom chloroplastowy u wątrobowca Marchantia polymorpha Liczy 121 024 par zasad w postaci kolistego DNA. Odpowiada to 128 genom, które zawierają: Zduplikowane geny kodujące każdą z czterech podjednostek (23S, 16S, 4.5S, i 5S) rybosomalnego RNA (rRNA) wykorzystywanego w chloroplaście 37 genów kodujących wszystkie tRNA używane do translacji w chloroplaście. 4 geny kodujące niektóre podjednostki RNA polimerazy używanej do transkrypcji w chloroplaście. Gen kodujący większą podjednostkę RUBISCO (ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase) 9 genów kodujących podjednstki składowe fotosystemu I i II 6 genów kodujących składniki ATP syntazy geny kodujące 19 z ~60 białek rybosomu chloroplastowego

Struktury i funkcjonowanie chloroplastów zależy od genów jądrowych, których rozliczne produkty muszą być importowane do chloroplastu

Filogeneza genomów chloroplastowych, utrata i transfer genów Phylogeny of chloroplast genomes, gene loss, and gene transfer. (A) Topology preferred by NJ and LD for chloroplast genomes. Branch lengths were estimated with ML using the JTT-F matrix. 1° and 2° endosymbiotic events are indicated. Gene losses inferred at branches are indicated with arrows, designating numbered blocks of genes, which are expanded as gene lists at left and bottom. Genes for which a transferred nuclear homologue was found are underlined. Gene presence matrix and accession numbers are given in Table 5. Numbers of parallel losses are color-coded. Support for branches (lowercase letters), is given in Table 2. (B) Alternative topolgies T2–T8 detected in various subsets of the data and with various methods. Dotted lines indicate that the topology is otherwise identical to T1. Martin W et al. PNAS 2002;99:12246-12251 ©2002 by National Academy of Sciences

Wymiana genów między jądrem a chloroplastem jest stale zachodzącym dynamicznym procesem