Sylwia Studnicka III rok OAM Gr A/B ANALITYCZNE ASPEKTY OZNACZENIA ENZYMÓW I ICH PRZYDATNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA. PROBLEMY ANALITYCZNE OZNACZANIA BILIRUBINY Sylwia Studnicka III rok OAM Gr A/B

ENZYMY Enzymy są to w większości białka, zdolne do katalizowania reakcji, w wyniku której następuje przekształcenie substratów w produkty poprzez obniżenie energii aktywacji tej reakcji.

Podział enzymów Ze względu na sposób przedostawania się do przestrzeni pozakomórkowych: Enzymy sekrecyjne: - powstają w narządach miąższowych i wydzielane są do krwi, gdzie pełnią prawidłowe funkcje; - obniżenie ich aktywności w surowicy = zaburzenia danego narządu. Enzymy ekskrecyjne: - syntetyzowane są przez komórki narządów wydzielniczych i zostają wydzielone do śliny, do światła przewodu pokarmowego, itp. - występowanie ich w surowicy wynika z przeszkód w odpływie płynów wydzielniczych (żółci, soku trzustkowego). Enzymy wskaźnikowe: - nie występują w prawidłowej surowicy lub aktywność ich jest niewielka w porównaniu z aktywnością wewnątrz komórek; - dostają się do krążenia wskutek uszkodzenia komórek.  

Podział enzymów Wskaźnikowe Sekrecyjne Ekskrecyjne niespecyficzne narządowo specyficzne narządowo lipaza lipoproteinowa, ceruloplazmina, czynniki krzepnięcia i fibrynolizy ● ślinianek: amylaza śl. ● trzustki: amylaza trzustkowa, lipaza trzustkowa, DN-aza, RN-aza ● stercza: fosfataza kwaśna ● gruczołów wydzielniczych żołądka: pepsynogen ● e. glikolizy: heksokinaza, fosfogliceromutaza, izomeraza, PK, LDH ● e. cyklu pentozo-fosforanowego: dehydr. Glu-6-P, transketolaza ● e. cyklu Krebsa: dehydr. Izocytrynianowa, Jabłczanowa, fumaraza ● e. przemian białek: AspAT, AlAT, GGT, GLD ● e. przemian puryn: dezaminaza adenozyny, oksydaza ksantyny ● w wątrobie: -dehydrogenaza alkoholowa -aldolaza Fru-1-P -dehydrogenaza sorbitolowa -arginaza ●w mm poprzecz. prążkowanych: - aldolaza Fru-1,6-P2 - kinaza kreatynowa

Izoformy zmiana fosforylacji asocjacja z innymi białkami, agregacja Są to odmienne fizycznie postacie enzymu, powstające w wyniku jego modyfikacji potranslacyjnej: zmiana fosforylacji asocjacja z innymi białkami, agregacja zmiana bocznego łańcucha węglowodanowego częściowe rozszczepienie łańcucha deaminacja acylacja utlenienie gr. SH

Izoenzymy (izozymy) Fizycznie różniące się postacie danego enzymu, kodowane w DNA. Katalizuję tę samą reakcję, ale występują między nimi różnice w: - wrażliwości na temperaturę - powinowactwie do substratu - właściwościach immunologicznych - ruchliwości elektroforetycznej przykłady izoenzymów: - dehydrogenaza mleczanowa (LDH) -kinaza kreatynowa (CK)

Standaryzacja metod Ochrona enzymu przed inaktywacją termiczną, degradacją proteolityczną, utlenianiem; bufor testowy powinien chronić enzym przed hamowaniem nadmiarem produktu; pomiar aktywności należy wykonywać w temperaturze 37°C; zakres roboczy metody powinien odpowiadać zakresowi mierzonej aktywności; możliwość porównywania wyników;

Standaryzacja metod Stworzenie standardów metodycznych przez Międzynarodową Federację Chemii Klinicznej – standardy IFCC; określenie wartości referencyjnych Ujednolicenie jednostek aktywności enzymatycznej: Jednostka międzynarodowa – IU – ilość enzymu przekształcająca 1 mikromol substratu w ciągu 1 minuty Katal – kat – ilość moli substratu przekształcanego w produkt w czasie 1 sekundy przez 1 litr badanej próbki

Diagnostyka Przyczyny zmian aktywności lub stężenia enzymów w surowicy: proliferacja komórek; biosynteza enzymów wewnątrzkomórkowych; zmiana przepuszczalności błon komórkowych; nasilony rozpad komórek (w wyniku procesów patologicznych); upośledzona biosynteza enzymów sekrecyjnych w stanach ciężkich uszkodzeń narządów miąższowych; utrudniony odpływ płynów zawierających enzymy ekskrecyjne. Zmiany te wywołane są przez: urazy zewnętrzne → zmiażdżenie tkanki, oparzenia urazy wewnętrzne → krwotoki stany zapalne procesy zwyrodnieniowe i martwicze

Lokalizacja enzymów w organellach komórkowych Lokalizacja enzymu Przykład cytoplazma Aldolaza LDH AlAT mitochondria enzymy cyklu Krebsa GLDH AspAT retikulum endoplazamatyczne esterazy reduktazy fosfataza Glu-6-P rybosomy enzymy syntezy białek, ceruloplazmina esteraza cholinowa lizosomy proteazy fosfatazy kolagenazy siateczka endoplazmatyczna GGT

Diagnostyka a lokalizacja Ze względu na umiejscowienie enzymów w komórce, stopień uszkodzenia tkanki ma wpływ na poziom i rodzaj enzymów komórkowych w osoczu. ● Lekkie uszkodzenia komórek powodują ucieczkę do osocza białek i enzymów cytoplazmatycznych. ● W ciężkich uszkodzeniach komórek w osoczu pojawiają się enzymy mitochondrialne.

KINAZA KREATYNOWA (CK) – enzym wskaźnikowy Izoenzymy: CKMM, CKMB, CKBB w osoczu ludzi zdrowych CKMM stanowi 95% aktywności całkowitej (CKcałk) do obniżenia aktywności CKMM dochodzi w wyniku zmniejszenia masy mięśni oznaczanie aktywności CKcałk i CKMBcat pozwala na potwierdzenie wystąpienia zawału w ciągu pierwszej doby tylko u ok. 70% chorych; skuteczniej wykrywa się stan zawałowy we wcześniejszych etapach oznaczając izoformy sercowe białek – troponiny I oraz T oraz mioglobinę; preferuje się także oznaczenia stężenia CKMBmass   znaczny wzrost – ponad 5-krotny zawał serca zapalenie mięśnia sercowego urazy mięśni dystrofia mięśniowa wstrząs niewydolność krążenia umiarkowany wzrost zapalenia mięśni po injekcjach stany pooperacyjne rozległe uszkodzenie tkanki nerwowej

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) Izoenzymy LDH1 – LDH5 obecne są w mózgu, płucach, leukocytach, mm szkieletowych, erytrocytach, mm sercowym, płytkach krwi, nerkach, wątrobie. Swoistą izoformą dla mięśnia sercowego jest LDH1 , o długim okresie półtrwania (ok. 100 godzin); specyficzna dla wątroby – LDH5 ma krótki czas półtrwania (do 10 godzin). W osoczu osób zdrowych dominuje izoenzym LDH2. duży wzrost aktywności z przewagą LDH1, LDH2 zawał serca (marker późny) niedokrwistość megaloblastyczna ostre białaczki ciężkie uszkodzenie nerek z przewagą LDH5 choroby wątroby choroby mięśni szkieletowych  umiarkowany wzrost aktywności całkowitej (objaw nieswoisty)  zawał płuc i mózgu procesy nowotworowe

FOSFATAZA ZASADOWA (ALP) – enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny Trzy izoenzymy, niespecyficzne tkankowo, kodowane są przez jeden gen – w wątrobie, tkance kostnej i nerkach. Trzy izoenzymy – jelitowy, łożyskowy i komórek zarodkowych kodowane są przez 3 geny swoiste tkankowo. Izoenzym Przykład choroby wątrobowa ALP ↑ choroby wątroby, cholestaza kostna ALP ↑ nowotworowe i nienowotworowe choroby kości jelitowa ALP ↓ przewlekłe choroby wątroby żółciowa i makromolekularna ALP ↑ cholestaza i przerzutowe guzy wątroby łożyskowa ALP↑ nowotwory płuc, jajników, macicy, jąder, układu żołądkowo-jelitowego ALP komórek zarodkowych↑ nowotwory zarodkowe, przysadki, grasicy

FOSFATAZA KWAŚNA (ACP) – enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny Izoenzymy: wątrobowy, nerek, stercza, kostny oraz izoformy izoenzymu kostnego wytwarzane w neutrofilach, erytrocytach, płytkach krwi, śledzionie. U dzieci w okresie pokwitania aktywność ACP jest 2-5 razy wyższa, niż u dorosłych. U dorosłych zdrowych mężczyzn ok. 30% aktywności całkowitej ACP stanowi aktywność izoenzymu stercza. całkowita aktywność ACP ↑ choroba Pageta, przerzuty nowotworowe do kości, szpiczak, akromegalia, osteoporoza, hemoliza ACP stercza (PAP) ↑ przerost, zapalenie, rak gruczołu krokowego

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA – AST, enzym wskaźnikowy zlokalizowana jest w cytoplazmie i mitochondriach komórek wątroby, mięśni szkieletowych i serca, w erytrocytach, komórkach kanalików nerkowych ma znaczenie w diagnostyce schorzeń wątroby  AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA – ALT, enzym wskaźnikowy ALT występuje wyłącznie w cytoplazmie (w komórkach wątroby i nerek wyższy poziom; niższy – w mięśniach; w niewielkich ilościach obecna w komórkach wszystkich innych tkanek). ALT jest względnie swoista dla hepatocytów dogodny test skriningowy do wykrywania stanów zapalnych wątroby (zakażenie HBV, HCV, alkoholizm, leki hepatotoksyczne) Aktywność AST i ALT w prawidłowej surowicy jest nieco wyższa u mężczyzn, niż u kobiet; u noworodków jest większa 1,5- 2 razy, niż u dorosłych.

AMINOTRANSFERAZA ASPARAGINIANOWA AMINOTRANSFERAZA ALANINOWA AST ALT Duży wzrost wirusowe zapalenie wątroby toksyczne uszkodzenie wątroby nowotwory, białaczki, chłoniaki zapalenie dróg żółciowych zawał mm sercowego ostre reumatoidalne zapalenie mm sercowego ciężka niewydolność krążenia hemoliza zmiażdżenia wątroby, mięśni Łagodny wzrost   przewlekłe choroby mięśni niewydolność krążenia bez zawału przewlekłe zapalenia wątroby cholestaza zapalenie trzustki mononukleoza ostra niewydolność nerek choroby mięśni szkieletowych marskość wątroby żółtaczka zastoinowa

DEHYDROGENAZA GLUTAMINIANOWA – GLDH, enzym wskaźnikowy enzym zlokalizowany w mitochondriach wątroby Duży wzrost aktywności WZW śpiączka wątrobowa przewlekłe agresywne zapalenie wątroby żółtaczka zastoinowa Umiarkowany wzrost aktywności pierwotny rak wątroby wtórne nowotwory wątroby

GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA – GGT, enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny enzym zlokalizowany w błonach komórek o aktywnym transporcie aminokwasów - nabłonku wątroby, trzustki, jelita dróg żółciowych, kanalików nerkowych GGT obecna we krwi pochodzi głównie z wątroby aktywność w prawidłowej surowicy u kobiet nieco niższa, niż u mężczyzn; duża aktywność u noworodków i niemowląt w pierwszych miesiącach życia

GAMMA-GLUTAMYLOTRANSFERAZA – GGT, enzym wskaźnikowy/ekskrecyjny zmiany aktywności GGT wyraźnie korelują ze zmianami aktywności ALP enzym podlega indukcji przez barbiturany, fenytoinę, estrogeny, spożywany alkohol   Duży wzrost aktywności choroby zastoinowe wątroby choroby dróg żółciowych nowotwory wątroby stany zapalne trzustki nowotwory trzustki przewlekły alkoholizm

ALFA-AMYLAZA – AMS, enzym ekskrecyjny W surowicy obecnych jest 8 izoenzymów pochodzących z trzustki, ślinianek, błony, śluzowej jelita cienkiego, gruczołów mlecznych, jajników, jąder Diagnostycznie wykorzystuje się oznacznie aktywności całkowitej lub izoenzymu trzustkowego w surowicy i moczu w chorobach trzustki i przewodu pokarmowego AMS jest białkiem małocząsteczkowym – podlega przesączaniu do moczu (białkomocz przednerkowy) i jest dobrym odzwierciedleniem poziomu we krwi; oznaczanie AMS w moczu może być dogodne w monitorowaniu schorzeń trzustki.

ALFA-AMYLAZA – AMS, enzym ekskrecyjny

LIPAZA TRZUSTKOWA – LP, enzym ekskrecyjny enzym wytwarzany głównie w trzustce zmiany aktywności LP mogą być wywołane przez leki: - heparyna, kodeina, opioidowe leki przeciwbólowe zwiększają aktywność LP - chinina hamuje aktywność LP wzrost aktywności LP w ostrym zapaleniu trzustki utrzymuje się dłużej, niż aktywności AMS ze względu na swoistość narządową wzrost aktywności LP charakteryzuje się prawie 100% czułością w rozpoznawaniu OZT. Wzrost aktywności ostre zapalenia trzustki rak trzustki cholestaza pozawątrobowa z zajęciem trzustki

ELASTAZA1– enzym sekrecyjny trzustki Enzym nie ulega rozkładowi w jelicie cienkim i grubym, zawartość oznaczana w ekstrakcie próbki stolca odzwierciedla poziom elastazy wydzielanej do dwunastnicy. Duży spadek zawartości elastazy 1 poniżej normy wskazuje na ciężką niewydolność zewnątrzwydzielniczą trzustki.

CHOLINESTERAZA – ChE, enzym sekrecyjny wątroby enzym wydzielany z wątroby do krążenia do tej grupy należy AChE (rozkład acetylocholiny) – acetylocholinesteraza w komórkach układu nerwowego, w erytrocytach, płucach Znaczna zmienność międzyosobnicza aktywności ChE ogranicza jej przydatność jako pojedynczego testu w rozpoznawaniu uszkodzenia wątroby

CHOLINESTERAZA – ChE, enzym sekrecyjny wątroby ChE jest użyteczna w monitorowaniu przewlekłych chorób wątroby ↓ aktywności ChE świadczy o znacznym uszkodzeniu miąższu wątroby i zahamowaniu syntezy białek miąższowe choroby wątroby zatrucia związkami fosfoorganicznymi środki cytotoksyczne wstrząs pourazowy wrodzone niedobory enzymu niedożywienie ↑ aktywności ChE zespoły nerczycowe, nadczynność tarczycy okres rekonwalescencji po uszkodzeniu wątroby

Inne enzymy sekrecyjne Lipaza lipoproteinowa – różnicowanie zaburzeń gospodarki lipoproteinowej. Enzymy krzepnięcia i fibrynolizy – czynniki II, V, VII, IX, X: pomiar czasu protrombinowego jest miarą ich stężenia w surowicy. Ceruloplazmina – gromadzenie jonów miedzi w wątrobie wywołuje spadek poziomu ceruloplazminy w osoczu.

Izoenzymy jako markery chorób nowotworowych Wykrywane są częściej w stadiach zaawansowanych, niż we wczesnych etapach, Monitorowanie ich aktywności w surowicy pozwala na ocenę skuteczności terapii oraz na wczesne wykrycie nawrotu choroby. Przykłady: Enolaza– enzym glikolityczny ALP ACP - Wzrasta aktywność u ok. 50% chorych z zaawansowanym rakiem stercza. izoenzym wątrobowy ALP ↑ guzy przerzutowe do wątroby frakcje rakowo-łożyskowe ALP ↑ guzy jajników, trzustki, okrężnicy, piersi, płuc

Izoenzymy jako markery chorób nowotworowych GGT – wzrost aktywności w nowotworach wątroby, zwłaszcza z towarzyszącą cholestazą. LDH PSA (prostate specific antygen) – proteza serynowa wydzielana przez komórki nabłonkowe kanalików zdrowego stercza, ale również przez nabłonek gruczolakoraka i raka stercza. wzrost poziomu LDH3 nowotwory o dużej dynamice wzrostu wzrost poziomu LDH1, LDH2 chłoniaki, białaczki (zła prognoza)

Bilirubina Pomarańczowoczerwony barwnik żółciowy, będący produktem rozpadu hemu hemoglobiny i innych hemoprotein Bilirubina słabo rozpuszcza się w wodzie, dlatego w osoczu krwi transportowana jest w połączeniu z albuminą Frakcja bilirubiny nietrwale związanej z albuminami nazywana jest bilirubiną wolną lub pośrednią. Bilirubina wolna nie przedostaje się do moczu, ale może przenikać przez barierę krew-mózg

Bilirubina Bilirubina wolna transportowana jest do wątroby, gdzie następują jej dalsze przemiany do rozpuszczalnej w wodzie bilirubiny związanej (bezpośredniej), przez co traci zdolność przenikania przez barierę krew-mózg i traci właściwości neurotoksyczne UDP-glukuronozylotransferaza sprzęga bilirubinę z kwasem glukuronowym (glukuronianem) Bilirubina związana wydzielana jest aktywnie do żółci, skąd dalej trafia do jelita. Jest tam przekształcana w barwniki żółciowe – urobilinogeny (sterkobilinogeny) przy udziale enzymów bakteryjnych

Właściwości bilirubiny Bilirubina jest związkiem wrażliwym na działanie światła naturalnego i sztucznego. W czasie ekspozycji na światło dochodzi do jej izomeryzacji i utleniania W diagnostyce laboratoryjnej ekspozycja na światło może wpłynąć na wynik oznaczania bilirubiny, zaniżając jej stężenie, jeśli próbka nie była chroniona przed światłem

Hiperbilirubinemia Może być spowodowana upośledzeniem sprzęgania bilirubiny w wątrobie lub zaczopowaniem przewodów żółciowych, a także wytwarzaniem większej ilości bilirubiny niż jest w stanie wydzielić do przewodów żółciowych prawidłowo funkcjonująca wątroba. Przy stężeniu bilirubiny w osoczu przekraczającym 2-2,5 mg/100 cm3 dyfunduje ona do tkanek dając obraz kliniczny określany mianem żółtaczki. Przyczyną podwyższonego stężenia bilirubiny przedwątrobowej może być też niedokrwistość hemolityczna, a także dziedziczne zaburzenia sprzęgania bilirubiny w wątrobie.

Hiperbilirubinemia Podwyższony poziom bilirubiny wolnej może być też spowodowany uszkodzeniem miąższu wątroby, powstałym w następstwie: WZW, marskości wątroby, zatruć, długotrwałego stosowania hepatotoksycznych leków, czemu towarzyszy upośledzenie wydzielania do żółci sprzężonej bilirubiny. Hiperbilirubinemia spowodowana wzrostem stężenia bilirubiny sprzężonej wiąże się z obecnością bilirubiny w moczu (bilirubinuria), podczas gdy wolna bilirubina (skompleksowana z albuminą) nigdy nie pojawia się w moczu.

Bilirubina jako marker w diagnostyce laboratoryjnej U zdrowych ludzi stężenie bilirubiny wynosi 1 - 1,3 mg/dl (17,1 - 22,2 μmol/l). Stężenie to jest fizjologicznie wyższe u dzieci do 1 miesiąca życia, zwłaszcza u wcześniaków, u których prawidłowe stężenie może sięgać nawet do 16 mg/dl (273,6 μmol/l) w 3-5 dniu życia Podwyższone stężenie bilirubiny określa się jako hiperbilirubinemię. U chorych bilirubina sprzężona może przenikać do moczu. Taki stan nazywa się cholurią

Metody oznaczania bilirubiny WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA (HPLC) pozwala rozdzielić bilirubinę na 4 frakcje: – alfa – frakcja bilirubiny wolnej – beta – frakcja bilirubiny sprzężonej (monoglukuronid bilirubiny) – gamma – frakcja bilirubiny sprzężonej (diglukuronid bilirubiny) – delta – frakcja bilirubiny sprzężonej, związanej kowalencyjnie z albuminami; nie występuje u osób zdrowych i pojawia się przy wysokich, utrzymujących się stężeniach bilirubiny sprzężonej; utrzymuje się we krwi ok. 2 tygodni Metoda HPLC nie ma szerokiego zastosowania w rutynowej diagnostyce.

Metody oznaczania bilirubiny REAKCJA EHRLICHA – reakcja, w której dwuazowy kwas sulfanilowy reaguje z bilirubiną, w wyniku czego powstają dwa barwne izomery (w pH obojętnym obserwujemy kolor purpurowy, w pH kwaśnym lub zasadowym obserwujemy kolor niebieski)

Metody oznaczania bilirubiny METODA JENDRASSIKA–GROFA (zmodyfikowana) – wykorzystywana do bezpośredniego oznaczania bilirubiny wolnej i sprzężonej – dokonuje się dwukrotnie pomiaru kolorometrycznego przy dwóch długościach fali – 400 i 460 nm. – pierwszy pomiar pozwala określić stężenie bilirubiny całkowitej – drugi pomiar wykorzystuje różnicę w molowej zdolności absorpcyjnej frakcji wolnej i sprzężonej

METODY OZNACZANIA BILIRUBINY W MOCZU Przy użyciu testów paskowych Bilirubina może krystalizować w moczu o kwaśnym pH, zwłaszcza po schłodzeniu, a jej kryształy są widoczne podczas analizy osadu moczu najczęściej w postaci żółto-brązowych igieł Wyniki zaniżone: wysokie stężenie witaminy C, azotyny, ekspozycja na światło Wyniki fałszywie dodatnie: NSLPZ

Bilirubinometr Jest to urządzenie do nieinwazyjnego, przezskórnego pomiaru poziomu bilirubiny, również w czasie i po fototerapii noworodków. Na pomiar nie ma wpływu płeć, rasa, wiek urodzeniowy, ani waga noworodka. Pomiaru dokonuje się przez skierowanie białego światła w skórę noworodka i badanie intensywności powracających fal o określonej długości. Znając spektralne właściwości składników skóry, można wydzielić składniki zakłócające i określające koncentrację bilirubiny.

Dziękuję za uwagę