Krzywe kalibracyjne Anna Kolczyk gr. B2

Kalibracja Kalibracja – odpowiedź instrumentu na określone stężenie lub aktywność danego parametru Sygnał = f(stężenie) przewodnictwo elektryczne potencjał elektryczny absorbancja aktywność izotopowa chemiluminescencja

Funkcja analityczna (ang Funkcja analityczna (ang. analytical function) - odwrotna postać funkcji kalibracyjnej x=F-1(y) Jest wprost wykorzystywana do obliczenia poszukiwanego stężenia analitu. Kalibracja analityczna składa się z trzech etapów: laboratoryjnego (sporządzania roztworów wzorcowych) pomiarowego (konstruowania wykresu kalibracyjnego) matematycznego (obliczanie wartości wyniku)

Klasyfikacja metod kalibracyjnych Interpolacyjne (zakres wyznaczony doświadczalnie) Ekstrapolacyjne (po za zakresem doświadczalnym) Wskaźnikowe (wynik oblicza się na podstawie położenia na wykresie kalibracyjnym pkt charakterystycznego odmiennego (od strony matematycznej) od innych pkt tworzących ten wykres. Do wszystkich metod potrzebna jest krzywa kalibracyjna. Np. miareczkowanie 

Przygotowanie krzywej wzorcowej Roztwory wzorcowe o znanym stężeniu (zbliżonym do próbek badanych) o wzrastającym stężeniu (3-10) Roztwory wzorcowe muszą mieć taką samą matrycę jak próbki badane. Pomiar trzykrotny i uśrednienie wyników (odrzucenie błędów grubych) Sporządzenie krzywej

Do sporządzenia krzywej kalibracyjnej należy stosować wiarygodne materiały odniesienia (certyfikowane CMR). Kalibracja przyrządu jest czynnością wstępnej walidacji. Certyfikowany materiał odniesienia CMR – materiał odniesienia opatrzony certyfikatem, dla którego każdej wartości przypisana jest niepewność na określonym poziomie ufności.

Czynniki interferujące (wpływające na sygnał) substancje towarzyszące (matryca próbki) efekt matrycowy. Matryca - tło na bazie którego wykonywane jest oznaczenie, zawiera wszystkie składniki z wyjątkiem analitu. Jeżeli wykonujemy oznaczenie w osoczu, to jest ono matrycą. Interferencje fizyczne (np. temp pomiaru) Dokładność i niepewność wyniku pomiaru

Rodzaj przyrządu pomiarowego Czas analizy W przypadku oddziaływania stałej ilości interferenta na zmienne ilości analitu, zmiany sygnału mogą mieć stałą wielkość - efekt addytywny, lub wielkość proporcjonalną do stężenia analitu – efekt multiplikatywny.

Rodzaje krzywych kalibracyjnych Prostoliniowa Nieprostoliniowa Powtarzalna Niepowtarzalna

Prostoliniowa i powtarzalna

Prostoliniowe niepowtarzalne

f(x)=ax+b Prostoliniowe krzywe kalibracyjne są najbardziej pożądane. Można wyznaczyć równanie prostej. Równanie regresji liniowej (najmniejszych kwadratów): f(x)=ax+b

Powtarzalna nieprostoliniowa

Niepowtarzalna nieprostoliniowa Krzywą należy wykonać przy każdej serii pomiarowej.

Zakres pomiarowy to przedział pomiędzy najwyższym i najniższym stężeniem, jakie mogą zostać oznaczone za pomocą danej metody pomiarowej z założoną precyzją, dokładnością i liniowością. W przypadku krzywych nieprostoliniowych badanie wykonujemy w ograniczonym zakresie stężeń prostoliniowych. Wyróżnia się: dynamiczny zakres wskazań przyrządu, liniowy zakres wskazań

Za koniec zakresu prostoliniowego przyjmuje się punkt, w którym odchylenie od prostoliniowości nie przekracza 3%. Yteor – sygnał dla roztworu o najwyższym stężeniu, wyznaczony metodą najmniejszych kwadratów (regresji liniowej) Yrzecz – sygnał rzeczywisty dla roztworu o najwyższym stężeniu, wyznaczony eksperymentalnie.

Metoda dodatku wzorca Stosuje się w oznaczeniach ilościowych, gdy do oznaczenia pozostaje wiele próbek różniących się składem matrycy, która dodatkowo jest złożona lub nieznana (np. krew, osady rzeczne, surowica). Warunkiem jest wprost proporcjonalna zależność rejestrowanego sygnału od stężenia oraz sygnał ślepej próby jest zerowy.

Zasada metody: Dodawanie niewielkich ilości wzorca do badanej próbki Matryca próbki i wzorca musi być identyczna Pomiar najpierw dla nieznanej próbki, następnie po każdorazowym dodaniu wzorca Znana jest różnica stężeń, a nie stężenie próbki badanej ! Obliczanie stężenia nieznanej próbki: xm=-a/b gdzie a, b to współczynniki funkcji kalibracyjnej y = bx+a

Metoda porównania ze wzorcem Kalibracja jednopunktowa Stężenia wzorca i analitu są zbliżone, a matryce identyczne

Współczynnik korelacji r Współczynnik korelacji liniowej Pearsona – współczynnik określający poziom zależności liniowej między zmiennymi losowymi. (Zgodność zależności sygnału od stężenia).

x- stężenie y- sygnał - średnie arytmetyczne

interpretacja r∈[-1,1] r=0 brak zależności liniowej gdy r>0 - korelacja dodatnia - wzrostowi wartości zmiennej X towarzyszy wzrost wartości zmiennej Y gdy r<0 - korelacja ujemna - wzrostowi wartości zmiennej X towarzyszy spadek wartości drugiej zmiennej < 0,2 brak związku liniowego 0,2 - 0,4 słaba zależność 0,4 -0,7 umiarkowana zależność 0,7 - 0,9 dość silna zależność > 0,9 bardzo silna zależność Korelacje Ujemne Dodatnie Słabe −0,5 do 0,0 0,0 do 0,5 Silne −1,0 do −0,5 0,5 do 1,0

Koniec