Typy analiz z wykorzystaniem mikromacierzy Ekspresja genów Detekcja mutacji i polimorfizmów Genotypowanie (SNP)
Dwie platformy badań mikromacierzowych Mikromacierze oligonukleotydowe Mikromacierze cDNA
Eksperyment na dwóch platformach badan mikromacierzowych
Charakterystyka sond stosowanych do konstrukcji mikromacierzy Komplementarne do konca 3’ transkryptu Bez sekwencji palindromowych Unikatowe czesci danego transkryptu do selektywnego rozróznienia transkryptów niewiele rózniacych sie od siebie: •Geny blisko spokrewnione ze soba •Geny z jednej rodziny genowej •Warianty alternatywnego skladania mRNA
Podłoża mikromacierzy Sztywne Podatne na chemiczne modyfikacje powierzchni Roztwór sondy nie powinien wnikac w podloze ani dyfundowac w nim O niskiej fluorescencji Plastik, szklo pokryte polilizyna lub aminosilanem Podloza pokryte nitroceluloza, nylonem, zelem, filtry nylonowe Modyfikacje powierzchni podloza w celu zwiekszenia zdolnosci absorbowania sondy
Techniki nanoszenia sond na mikromacierz Techniki kontaktowe Narzedzia: igly, pincety, kapilary Objetosc nanoszona na powierzchnie od kilku do wielu nanolitrów Srednica punktu 100-250µm Techniki bezkontaktowe Ink-jet Z wysoko rozdzielcza strzykawka polaczona z mikrosolenoidowym zaworem
Nanoszenie sond na powierzchnie mikromacierzy
Synteza fotolitograficzna in situ sond oligonukleotydowych typu GeneChip Affymetrix
Błędy na różnych etapach eksperymentu Nanoszenie próbek; różna wydajność nakładania mechaniczne zużycie końcówek różne temperatury i wilgotność PCR różna wydajność Przygotowanie sond odwrotna transkrypcja i znakowanie są etapami które trudno kontrolować degradacja RNA
Błędy na różnych etapach eksperymentu Przygotowanie podłoża Skanowanie i analiza danych inna częstość znakowania przez różne barwniki fluorescencyjne wysycenie pomiaru lokalizacja próbek
Zliczanie pikseli
Różne barwniki - różne intensywności