Adriana Palińska Porównanie technik elektrochemicznych w zastosowaniu do bioczujników DNA PRACOWNIA TEORETYCZNYCH PODSTAW CHEMII ANALITYCZNEJ Adriana Palińska Kierownik pracy: dr hab. Magdalena Maj-Żurawska Modyfikacja klasycznej gazowej elektrody tlenowej Clarka, przez umieszczenie na jej powierzchni enzymu, otworzyła drogę rozwoju bioczujników chemicznych. Na szczególną uwagę zasługują biosensory, w których biologicznym elementem receptorowym jest warstwa DNA. Kwas deoksyrybonukleinowy jako nośnik informacji genetycznej odgrywa ogromną rolę w procesach biologicznych. Badania z jego udziałem dostarczają wielu istotnych informacji na temat sekwencji nukleotydowych oraz jego oddziaływań z różnymi indywiduami chemicznymi. Z tego też powodu przywiązuje się ogromną wagę do rozwoju stosowanych technik pomiarowych. Wiele spośród tych metod wciąż wymaga ulepszeń technicznych i poprawy parametrów pomiarowych. Potężnym narzędziem analitycznym w badaniach z bioczujnikami DNA jest elektrochemia. W swojej pracy badawczej skupiłam się na metodach woltamperometrycznych i optymalizacji ich warunków. APARATURA UKŁAD POMIAROWY WYNIKI POMIARÓW Pomiary wykonane zostały przy pomocy trójelektrodowych układów sitodrukowanych (SPE) (Rys.6). Krzywa kalibracyjna MB metodą SWV i DPV – sygnał DNA elektroda pseudoodniesienia (srebrowa) Rys. 4 – AUTOLAB PGSTAT12 elektroda pracująca (grafitowa) CELE PRACY optymalizacja parametrów pomiarowych badania oddziaływania DNA z błękitem metylenowym (MB) metodą woltamperometrii cyklicznej (CV), różnicowej woltamperometrii pulsowej (DPV) oraz woltamperometrii fali prostokątnej (SWV) wykonanie krzywych kalibracyjnych oddziaływania MB z DNA badanego przy pomocy DPV i SWV dobór najlepszej metody woltamperometrycznej do badania oddziaływania MB z DNA przez monitorowanie zmian sygnałów utlenienia zasad azotowych DNA – adeniny (A) i guaniny (G) oraz zmian sygnałów utlenienia i redukcji MB Badanie interakcji MB z DNA metodą CV, DPV i SWV – sygnał MB elektroda pomocnicza (grafitowa) Rys. 5 – SPE na mieszadle magnetycznym Rys. 6 – Układ elektrod sitodrukowanych (SPE) PROCEDURA ANALITYCZNA Krzywa kalibracyjna metodą SWV i DPV – sygnał DNA Przygotowanie powierzchni elektrody: +1,6V przez 120s; +1,8V przez 60s Roztwór: 0,25M bufor octanowy z 10mM KCl, pH = 4,75 (AcB); mieszanie 2.Rejestracja linii podstawowej: od +0,2V do +1.5V; SWV – Eamplituda= 0,04V, Ekrok= 0,015V, F = 200Hz; DPV - Eamplituda= 0,05V, Ekrok= 0,015V, szybkość przemiatania potencjału = 0,05V/s Roztwór: AcB; bez mieszania 3.Unieruchomienie DNA na powierzchni elektrody: +0,5V przez 300s Roztwór: 20ppm dsDNA ze spermy łososia w AcB; mieszanie 4.Oddziaływanie z MB lub ślepa próba (blank): 0V przez 120s Roztwór: MB w AcB lub czysty AcB (blank); mieszanie 5.Płukanie – usuwanie z powierzchni elektrody nadmiaru MB niezwiązanego z DNA: 0V przez 10s Roztwór: AcB; mieszanie 6.Pomiar sygnału utlenienia zasad azotowych (A i G): od +0,2V do +1,5V; SWV – Eamplituda= 0,04V, Ekrok= 0,015V, F = 200Hz; DPV - Eamplituda= 0,05V, Ekrok= 0,015V, szybkość przemiatania potencjału = 0,05V/s Badanie interakcji MB z DNA metodą CV, DPV i SWV – sygnał MB Przygotowanie powierzchni elektrody: +1,6V przez 120s; +1,8V przez 60s; 5 skanów CV od -0,5V do +1,6V, Ekrok=0,005V, szybkość przemiatania potencjału = 0,1V/s 2.Rejestracja linii podstawowej – tylko dla DPV i SWV: od -0,6V do +1,6V (utlenianie), od +1,6 do -0,6V (redukcja); DPV - Eamplituda= 0,05V, Ekrok= 0,015V, szybkość przemiatania potencjału = 0,1V/s; SWV – Eamplituda= 0,04V, Ekrok= 0,015V, F = 200Hz 3.Unieruchomienie DNA na powierzchni elektrody lub ślepa próba (blank): +0,5V przez 300s Roztwór: 20ppm dsDNA ze spermy łososia w AcB lub AcB (blank); mieszanie 4.Oddziaływanie z MB lub adsorpcja MB na elektrodzie (blank): 0V przez 120s 5.Płukanie – usuwanie z powierzchni elektrody nadmiaru MB: 0V przez 10s 6.Pomiar sygnału utlenienia i redukcji MB: od -0,6V do +0,2V (utlenianie), od +0,2V do -0,6V (redukcja); CV – 5 skanów Ekrok=0,005V, szybkość przemiatania potencjałem = 0,05V/s; DPV – Eamplitude=a= 0,05V, Ekrok= 0,015V, szybkość przemiatania potencjału = 0,1V/s; SWV – Eamplituda= 0,04V, Ekrok= 0,015V, F = 200Hz ELEKTROCHEMICZNE BIOCZUJNIKI DNA Elektrochemiczne bioczujniki DNA to urządzenia zawierające jako element receptorowy warstwę kwasu deoksyrybonukleinowego, nierozerwalnie połączoną z powierzchnią przetwornika elektrochemicznego – elektrody. Mogą być one stosowane między innymi to określania oddziaływań między cząsteczkami kwasu a różnorodnymi związkami chemicznymi, które wpływają na aktywność i strukturę DNA. Badanie to polega na obserwacji zmian sygnałów utlenienia zasad azotowych DNA lub utlenienia/redukcji danego ligandu (Rys. 1). chemiczna lub strukturalna modyfikacja DNA przez ligandy zmiana sygnału analitycznego reakcji redoks zasad azotowych lub analitu WNIOSKI badanie interakcji MB z DNA lepiej jest prowadzić przez monitorowanie zmian sygnału utlenienia G (MB nie oddziałuje z A), niż sygnału redoks MB, gdyż otrzymane wyniki charakteryzują się mniejszym rozrzutem; problemem przy oznaczaniu sygnału redoks błękitu metylenowego może być jego niekontrolowana adsorpcja na powierzchni elektrody obserwacje zmiany sygnału utlenienia guaniny lepiej jest prowadzić metodą SWV, niż DPV; gwarantuje to wyższe sygnały oraz mniejsze wartości odchylenia standardowego przy monitorowaniu reakcji redoks MB, niezależnie od zastosowanej metody, bardziej stabilne sygnały otrzymuje się dla procesu redukcji niż utlenienia na tym etapie badań nie można stwierdzić, która z metod jest najwłaściwsza do monitorowania reakcji redoks MB, gdyż CV, DPV i SWV dają częściowo odmienne wyniki, jeśli chodzi o wzrost/spadek sygnału MB w wyniku dodatku DNA; przyczyną tego może być prowadzenie pomiaru cyklami na tej samej elektrodzie dla CV, zaś w przypadku SWV i DPV oddzielne badanie procesów utlenienia i redukcji (eksperyment ten wymaga dalszych badań) unieruchomiona warstwa DNA Rys. 1 – Schemat działania elektrochemicznego biosensora DNA do badania interakcji kwasu deoksyrybonukleinowego z ligandami BŁĘKIT METYLENOWY (MB) Wśród wielu substancji oddziałujących z DNA można wyróżnić błękit metylenowy (chlorek 3,7-bis-dimetyloaminofenotiazoniowy) (Rys. 2). Jest to heterocykliczny związek aromatyczny należący do grupy barwników fenotiazynowych. MB może oddziaływać z DNA (Rys. 3) według następujących mechanizmów: oddziaływanie elektrostatyczne –występuje ono między dodatnio naładowaną cząsteczką MB a szkieletem cukrowo – fosforanowym DNA interkalacja – polega na wsuwaniu się cząsteczek MB pomiędzy sparowane zasady azotowe DNA, przy czym błękit metylenowy wykazuje szczególne powinowactwo do par guanina – cytozyna oddziaływanie w bruzdach DNA – odbywa się ono za pośrednictwem wiązań wodorowych i występuje w obszarach bogatych w guaninę Rys. 2 – Wzór strukturalny błękitu metylenowego LITERATURA L.Z. Zhang, Guo-Qing Tang; Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 74 (2004) 119 S. Rauf, J.J. Gooding, K. Akhtar, M.A. Ghauri, M. Rahman, M.A. Anwar, A.M. Khalid; Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 37 (2005) 205 I. Szpakowska, B. Krassowska-Świebocka, D. Maciejewska, P. Kazimierczuk, W. Jemielita, M. Konrad, J. Trykowska, M. Maj-Żurawska; Electroanalysis 18 (2006) 1422 Rys. 3 – Interakcja MB z helisą DNA Rodzaj występujących interakcji jest uzależniony między innymi od siły jonowej roztworu, stosunku stężenia MB i DNA oraz sekwencji zasad łańcucha polinukleotydowego. Przy opracowywaniu wyników stosowałam test Grubbsa, by wyeliminować wyniki obarczone błędem grubym. Parametry testu: α = 0.05