Kwasy nukleinowe jako leki

Porównanie rodzajów strategii antysensowych

Podstawowe mechanizmy aktywności antysensowej

sekwencja komplementarna do specyficznej sekwencji celu molekularnego Pożądane cechy ON: długość 17 – 21 nukleotydów sekwencja komplementarna do specyficznej sekwencji celu molekularnego unikanie sekwencji: tworzących niepożądane struktury II-rzędowe, tworzących G-kwartety, motywów CpG odporność na działanie nukleaz zdolność do indukowania działania RNazy H brak efektów ubocznych Zalety Wady I generacja Oporność na działanie nukleaz Generowanie chiralności Aktywacja RNazy H Wiązanie z białkami/toksyczność II generacja Mniejsza toksyczność Brak aktywacji RNazy H Brak problemów stereochemicznych Gapmery ON chimeryczne (środek PS, na końcach OMe lub MOE) III generacja PNA Niewielka toksyczność Brak indukcji RNazy H Problemy z rozpuszczalnością LNA Duża odporność na działanie nukleaz Wysokie powinowactwo do mRNA

Strategie antysensowe – preparaty ON otrzymywane na drodze syntezy Sekwencja reakcji: 1. Przyłączanie 3’-fosforoamidynowych pochodnych nukleozydów z grupą 5’OH ochronioną grupą DMTr do wolnej grupy 5’OH nośnika lub poprzedniego nukleotydu. 2. Pozostające wolne grupy 5’OH blokuje się poprzez acetylację. 3. Po zsyntezowaniu łańcucha ON - sulfuryzacja Produkt końcowy: mieszanina ON o długości n (produkt dominujący), n-1, n-2, itd.. Z –zasada azotowa DMTr – 4,4’-dimetoksytrytyl Schemat syntezy ON na nośniku stałym

Strategie antysensowe Modele struktur II-rzędowych rybozymu „hammerhead” i enzymu DNA

Modyfikowane nukleotydy wykorzystywane do stabilizacji rybozymów i DNA-enzymów

„Wyciszanie genów” przez cząsteczki RNAi dsRNA – dwuniciowe RNA; RISC – RNA-induced silencing complex

Podstawowe techniki terapii genowej Substytucja – wprowadzenie genu, którego brak w organizmie chorym, a występuje w zdrowym Addycja – wprowadzany gen nie występuje także w organizmie zdrowym

Ogólny schemat procesu produkcyjnego otrzymywania terapeutycznego plazmidowego DNA

Terapeutyczne plazmidowe DNA; typowe specyfikacje procedury zwalniającej Test Specyfikacja Wygląd przejrzysty, bezbarwny roztwór Wielkość, miejsce cięcia zgodność z mapą plazmidu (elektroforeza restrykcyjnego w żelu agarozowym, analiza restrykcyjna) Kolisty plazmid DNA (forma CCC) >95% (elektroforeza w żelu agar., HPLC) DNA, E. coli <0,02 g/g plazmidowego DNA (Southern blot) Białko niewykrywalne (oznaczenie metodą BCA) RNA niewykrywalne (elektroforeza w żelu agar.) Endotoksyna <0,1 EU/g plazmidowego DNA (LAL) Sterylność brak wzrostu po 14 dniach (USP) Specyficzna aktywność Odpowiada standardowi referencyjnemu

Technologie transferu genów w somatycznej terapii genowej

Wirusowe nośniki genów Zasada ogólna: plazmidowe DNA wprowadzone do wirusów pozbawionych własnego materiału genetycznego Retrowirusy (+) Wysoka wydajność transfekcji; integracja chromosomalna (-) wielkość DNA do 10 000 pz; transfekcja tylko do komórek ulegających podziałowi; niebezpieczeństwo aktywacji onkogenów i insercyjnej mutagenezy; w zasadzie wyłącznie ex vivo. Adenowirusy Materiał genetyczny w postaci dwuniciowego DNA; nie następuje integracja chromosomalna; można transfekować komórki nieproliferujące, także in vivo. Adenowirusy II generacji (np. parwowirusy AAV) Materiał genetyczny w postaci jednoniciowego DNA; wymagają obecności wirusów pomocniczych; integracja chromosomalna w chromosomie 19 Problemy generalne: immunogenność; niebezpieczeństwo zanieczyszczenia preparatu wirusami zjadliwymi

Somatyczna terapia genowa - nośniki

Somatyczna terapia genowa - nośniki

Somatyczna terapia genowa - nośniki

Mitochondrialna terapia genowa - nośniki Symulacja komputerowa struktury DQAsomów