Enzymologia-2 Oczyszczanie enzymów

Wybór źródła białka: Preferowane drobnoustroje (kom. bakteryjne, grzybowe) Zwierzęta laboratoryjne Systemy nadekspresyjne w odpowiednich układach Podczas oczyszczania enzymu należy mierzyć i kontrolować: Stężenie białka Aktywność oczyszczanego enzymu Liczbę białek obecnych w preparacie

Niektóre metody oznaczania białka Błękit kumazyny R-250 (CBB) Przesunięcie lmax po związaniu białka 465 nm (czerwony)  595 nm (niebieski) CuSO4 – kwas bicynchoninowy Białko redukuje Cu(II) to Cu(I) w środowisku zasadowym; kwas bicynchoninowy (BCA) jest odczynnikiem chromogennym, specyficznym dla Cu(I); tworzy z nimi purpurowy kompleks o lmax = 562 nm

PORÓWNANIE NAJPOPULARNIEJSZYCH METOD OZNACZANIA BIAŁKA  

Oznaczanie aktywności enzymu Oznaczanie [P] preferowane wobec [S]; Warunki oznaczenia powinny być optymalne: pH, siła jonowa, wysycające stężenia substratu(ów) i obecność kofaktorów; Oznaczanie punktowe lub ciągłe? Wybór metody: preferowane techniki spektroskopowe (UV, vis); metody radiochemiczne – uniwersalne i dokładne ale drogie, pracochłonne i niebezpieczne; często stosowane metody sprzężone; Zawsze należy stosować oznaczenia kontrolne (tło) W przypadku metod sprzężonych należy zapewnić, że ilość enzymu katalizującego reakcję sprzężoną powinna być na tyle duża, aby reakcja ta nie była etapem limitującym

Hydroliza b-galaktozydów do metabolizowalnych heksoz ONPG Galactose ONP + b galactosidase

Reakcja sprzężona przekształcenie glukozy przez oksydazę glukozową w kwas glukonowy przy jednoczesnym utworzeniu nadtlenku wodoru redukcja H2O2 przez peroksydazę w obecności o-dianizydyny (DH2), która ulega utlenieniu tworząc barwny związek D:

Brak jednoznacznego kryterium czystości czyli nie istnieje uniwersalne kryterium, ale mówi się o następujących kryteriach cząstkowych : kryterium katalityczne - jednorodność katalityczna; pomiar uzyskanego efektu katalitycznego, czyli szybkości pozyskania produktu kosztem substratu, lub szybkości ubytku substratu (metoda spektrofotometryczna), kryterium jednorodności chemicznej - określa się za pomocą następujących technik: elektroforeza (PAGE) i elektroogniskowanie w żelu poliakryloamidowym, analiza immunochemiczna, kryterium molekularne - stała sedymentacji, masa cząsteczkowa, wartość współczynnika dyfuzji, rodzaj aminokwasów N- i C-końcowych, ilość mostków disiarczkowych.

Metody oceny czystości preparatów białkowych – kryterium jednorodności chemicznej Metody elektroforetyczne Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) Ogniskowanie izoelektryczne (IEF) Metody immunologiczne Western blotting Test immunoenzymatyczny ELISA

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących Etapy: Denaturacja (SDS/DTT/100 C) Separacja elektroforetyczna w żelu poliakrylamidowym – metoda ciągła lub nieciągła (Laemmli) Barwienie pasm (CBB, metoda srebrowa) Inne wersje: 1. Mocznik/DTT/Triton X-100 jako czynniki denaturujące 2. Żele gradientowe

Ogniskowanie izoelektryczne Rozdział dzięki różnicy punktów izoelektrycznych różnych białek. Gradient pH Białko zatrzymuje się w miejscu, którego pH odpowiada jego pI czyli w takim, w którym ładunek wypadkowy białka wynosi zero

Western blotting Etapy: SDS-PAGE Elektrotransfer z żelu na błonę /nitroceluloza, nylon, difluorek poliwinylidenu (PVDF)/ Barwienie błony: - metoda ogólna (Amido black) - metody specyficzne (koniugaty przeciwciał)*

Transfer białek Blokada Rozdział białek SDS-PAGE Dodatek 2˚ przeciwciała Dodatek 1˚ przeciwciała Dodatek substratu procedura dwuetapowa: a/ blokowanie miejsc niezajętych w wyniku inkubacji z BSA, albuminą jaja lub sproszkowanym odtłuszczonym mlekiem; b/ specyficzne wiązanie przeciwciała połączonego z markerem fluorescencyjnym, promienitwórczym lub enzymem katalizującym barwną reakcję (peroxidase, phosphatase)

Dodatek drugiego przeciwciała Blokowanie Wiązanie antygenu - próbki Dodatek substratu Przeciwciało sprzęgnięte ze studzienką Łatwo wykryć i określić ilość specyficznego białka antygenowego, występującego w ilości mniejszej niż nanogram Drugie przeciwciało rozpoznaje inny rejon wiązania tego samego antygenu białkowego, jest połączone z enzymem przekształcającym bezbarwny lub niefluoryzujący substrat w barwny produkt

Postęp procesu oczyszczania enzymu można śledzić Podsumowanie procesu oczyszczania syntazy GlcN-6-P z Candida albicans z lewej: analiza elektroforetyczna etapów oczyszczania poniżej: zestawienie parametrów procesu

Strategia oczyszczania enzymów

Dezintegracja komórek - problemy Komórki zwierzęce – brak ściany; duże rozmiary; łatwość rozbicia Komórki roślinne – ściana komórkowa (celuloza/ligniny/woski) duże rozmiary; polifenole obecne w wakuolach Bakterie - sztywna ściana komórkowa + błona zewnętrzna (tylko Gram-); niewielkie rozmiary; komórki sferyczne – szczególne problemy komórki rekombinowane – możliwe tworzenie ciał inkluzyjnych Grzyby - bardzo sztywna ściana (chityna/glikan); aktywne enzymy proteolityczne Problemy ogólne: utrata mechanizmów kontroli metabolizmu w momencie rozbicia komórek; efekty cieplne związane z zastosowaniem metod mechanicznych

Ciałka inkluzyjne Białka eukariotyczne produkowane w komórkach bakteryjnych bardzo często nie uzyskują właściwej struktury trzeciorzędowej i odkładają się w cytoplazmie jako nieaktywne, bezpostaciowe, nieotoczone żadną błoną złogi. Nieprawidłowe zwijanie takich białek jest konsekwencją zbyt niskiego potencjału redukcyjno-oksydacyjnego bakteryjnej cytoplazmy oraz braku enzymów katalizujących tworzenie wiązań disiarczkowych

Izolacja białka z ciał inkluzyjnych Oddzielenie poprzez kilkukrotne wirowanie Przemywanie osadu ciałek inkluzyjnych Rozpuszczanie osadu w buforach o właściwościach denaturujących (mocznik, chlorowodorek guanidyny) Rozpad agregatów białka, redukcja niespecyficznych wiązań disiarczkowych Oddzielenie frakcji rozpuszczonych białek przez wirowanie Renaturacja – wytworzenie warunków pozwalających na przyjęcie przez białko właściwej konformacji

Czynniki sprzyjające zachowaniu aktywności oczyszczanych enzymów kontrola pH kontrola temperatury zapobieganie niekontrolowanej proteolizie dodatek czynników stabilizujących zapewnienie właściwych warunków przechowywania

Zapobieganie proteolizie oczyszczanych enzymów Utrzymywanie odpowiednio niskiej temperatury Obecność inhibitorów proteaz W niektórych przypadkach – ultrafiltracja z limitem odcięcia <30 kDa Inhibitory proteaz: Fluorek fenylometylosulfonylu 0.5 mM Pepstatyna A 1 M E-64 /L-trans-epoksysukcinylo-leucylamido-(4-guanidyno)-butan 10 M EDTA 1 mM

Inhibitory proteaz serynowych: - PMSF - chymostatyna - leupeptyna - antypaina Inhibitory proteaz tiolowych: - NEM - pCMB Inhibitory metaloproteaz: - EDTA - 1,10-fenantrolina Inhibitory proteaz aspartylowych: - pepstatyna A"

Metody dezintegracji -mechaniczne (np.: mielenie w homogenizatorach), -fizyczne (ultradźwięki, prasy wysokociśnieniowe, szok osmotyczny lub ciśnieniowy, zamrażanie i rozmrażanie, suszenie), -chemiczne (detergenty, antybiotyki, rozpuszczalniki organiczne, kwasy i inne), -enzymatyczne ( enzymy lityczne, autoliza, liza fagowa),

METODY DEZINTEGRACJI KOMÓREK

Wybrane metody dezintegracji komórek

Prasa Frencha Zasada działania: W wyniki parcia wywieranego na zawartość komory przez tłok naciskany za pośrednictwem prasy hydraulicznej, rośnie ciśnienie w komorze oraz ciśnienie wewnętrzne w komórkach. Podczas uwalniania zawartości komory przez wąską dyszę, następuje gwałtowny spadek ciśnienia w zawiesinie (na zewnątrz komórek) do atmosferycznego. Ciśnienie wewnątrzkomórkowe także spada, ale wolniej. W efekcie, gradient ciśnienia po dwóch stronach błony cytoplazmatycznej powoduje jej pęknięcie, a w efekcie uwolnienie cytoplazmy.

Inne metody dezintegracji komórek Metody fizyczne Szok osmotyczny przeniesienie z roztworu o wysokim ciśnieniu osmotycznym do roztworu o niskim ciśnieniu osmotycznym Szok termiczny 80 C/gwałtowne ochłodzenie Metody enzymatyczne Bakterie: Gram-dodatnie lizozym + DNaza Gram-ujemne lizozym + DNaza + EDTA detergent niejonowy+ lizozym Grzyby: chitinaza + -glukanaza -glukuronidaza Komórki roślinne: celulaza

Zastosowanie wirowania do separacji składników komórek

Zatężanie roztworów białek w wyniku dodania do roztworu ziaren suchego, porowatego polimeru. Wielkość porów musi być tak dobrana, aby nie wnikały w nie cząsteczki białek (Sephadex G-25, glikol polietylenowy - PEG); w wyniku usunięcia nadmiaru wody oraz niewielkich cząsteczek poprzez dyfuzję przez półprzepuszczalną membranę (ultrafiltracja, dializa wobec suchego Sephadex-u lub PEG); w wyniku usunięcia wody pod zmniejszonym ciśnieniem (liofilizacja)

Ultrafiltracja Materiały używane do otrzymywania błon półprzepuszczalnych: Octan celulozy poliwęglan poliamidy PCW polisulfon Ultrafiltracja

Ultrafiltracja

Odsalanie i wymiana buforu Dializa Filtracja żelowa

Oczyszczanie i zatężanie poprzez wytrącanie wytrącanie poprzez zmianę pH (kwas octowy lub cytrynowy dla pH 3-4; dietanoloamina lub węglan sodu dla pH >8 wytrącanie poprzez zmianę siły jonowej (wysalanie) wytrącanie poprzez dodatek rozpuszczalnika organicznego wytrącanie poprzez dodatek polimeru organicznego (PEG) wytrącanie poprzez denaturację termiczną

Wytrącanie białek poprzez zmianę pH Rozpuszczalność białek zależy od pH roztworu. Rozpuszczalność danego białka jest najmniejsza przy pH odpowiadającym punktowi izoelektrycznemu (pHi) białka

Wysalanie białek Białka są wytrącane z roztworu w efekcie zwiększenia jego siły jonowej w wyniku dodania soli w postaci sypkiej lub stężonego roztworu. Stosowane sole: (NH4)2SO4, Na2SO4

Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi Białka są wytrącane w wyniku dodania do roztworu mieszających się z wodą, niedenaturujących rozpuszczalników organicznych. Najczęściej stosowane: aceton, etanol Operacje prowadzi się w temperaturach poniżej 0 C.

Chromatograficzne metody separacji białek Podstawa separacji są różnice we właściwościach fizykochemicznych białek: polarność chromatografia adsorpcyjna chromatografia hydrofobowa charakter jonowy chromatografia jonowymienna chromatoogniskowanie rozmiary cząsteczki chromatografia rozmiarów wykluczających kształt cząsteczki; aktywność biologiczna chromatografia powinowactwa

specyficzne oddziaływania Cecha jako podstawa rozdziału Cecha Metoda Skala wielkość / masa Wirowanie Filtracja żelowa Dializa ultrafiltracja Średnia Mała ładunek chromatografia jonowymienna elektroforeza preparatywna ogniskowanie izoelektryczne Duża rozpuszczalność zmiana pH zmiana siły jonowej zmiana stałej dielektrycznej denaturacja termiczna specyficzne oddziaływania chromatografia hydrofobowa chromatografia adsorpcyjna chromatografia powinowactwa

Schemat zestawu do chromatografii kolumnowej białek

LPLC < 5 bar MPLC 6 – 50 bar HPLC > 50 bar 1 bar = 0.1 MPa W oczyszczaniu białek stosuje się techniki chromatograficzne nisko-, średnio- i wysokociśnieniowe LPLC < 5 bar MPLC 6 – 50 bar HPLC > 50 bar 1 bar = 0.1 MPa

Chromatografia średniociśnieniowa System FPLC Fast Protein Liquid Chromatograph (FPLC)

Materiały stosowane jako nośniki (matryce) dla złóż chromatograficznych wykorzystywanych dla oczyszczania białek Matryca Czynnik sieciujący lub skład kopolimeru Zakres stabilności (pH) Uwagi Celuloza Dekstran Agaroza Sepharose Poliakrylamid Polistyren epichlorohydryna 2,3-dibromopropanol kopolimer dekstranu I agarozy produkt polikondensacji diwinylobenzen 2 – 12 3 - 14 2 – 14 2 – 11 bez ograniczeń tylko zawiesina j.w.

Chromatografia jonowymienna białek Rodzaje złóż: anionity (wymieniają aniony) kationity (wymieniają kationy) cellulose cellulose

Anionit czy kationit?

Chromatografia jonowymienna białek wybierz rodzaj złoża; dostosuj rodzaj buforu do rodzaju złoża (dla anionitów bufory kationowe, np. TRIS; dla kationitów bufory anionowe, np. fosforanowy); naniesienie próbki w roztworze o niskiej sile jonowej (<50 mM); elucja wzrastającym gradientem soli (zwykle 0 – 0.5 M KCl lub NaCl), gradientem pH (rzadziej stosowane) lub gradientem amfolitu Cechy chromatografii jonowymiennej: (+) następuje zagęszczenie próbki; praktycznie brak ograniczeń objętości próbki nanoszonej na kolumnę; łagodne warunki nanoszenia i elucji; wysoka rozdzielczość (-) bezwzględna konieczność zachowania niskiej siły jonowej próbki nanoszonej białka eluowane z kolumny roztworem o wysokiej sile jonowej

Low salt High salt

Rozdział wzrastające stężenie NaCl ResourceQ – anionit Rozdział wzrastające stężenie NaCl Odporność:

Chromatoogniskowanie Zasada metody: Po zrównoważeniu żelu (zwykle polietylenoimino-agaroza) buforem o stosunkowo wysokim pH, tworzy się gradient pH gradient wzdłuż kolumny w wyniku elucji buforem zawierającym amfolity o pH odpowiadającym dolnej granicy pożądanego gradientu. W rezultacie, wytwarza się stały gradient pH w buforze o niskiej sile jonowej. W miarę postępu elucji białka są wymywane ze złoża w roztworze, którego pH jest równe, lub nieco wyższe od pI białka. System FPLC: Kolumny Mono P (MonoBeads® podstawione aminami trzecio- lub czwartorzędowymi Amfolity: Polybuffer 74, Polybuffer 96 Separacja mioglobiny wieloryba, moglobiny końskiej i karboksy- hemoglobiny przez zastosowanie chromatoogniskowania FPLC Zalety: wysoka rozdzielczość, efekt ogniskowania; Wady: amfolity obecne w eluacie. Usuwanie poprzez filtrację żelową, ultrafiltrację lub dializę

Chromatografia adsorpcyjna Hydroksyapatyt: Ca10(PO4)6(OH)2 - krystaliczny - sferoidalny - ceramiczny Mechanizm adsorpcji: Wiązanie na powierzchni złoża, w którym uczestniczą jony Ca(II) i fosforanowe złoża oraz naładowane grupy funkcyjne białek Warunki adsorpcji: bufor fosforanowy Na/K (<20 mM) pH obojętne Warunki elucji: wzrastajacy gradient skokowy lub ciągły buforu fosforanowego (zwykle 10 – 500 mM) Bio-Rad Kolumna Bio-Scale CHT Type I Upakowana ceramicznym hydroksyapatytem (wielkość ziaren – 10 m)

Chromatografia hydrofobowa Inertne matryce funkcionalizowane grupami arylowymi lub alkilowymi. Matryce podstawione grupami alkilowymi są ogólnie bardziej hydrofobowe, niż matryce podstawione grupami arylowymi Mechanizm wiązania białek: wykorzystuje się obecność domen hydrofobowych na powierzchni cząsteczek białka; siła napędowa – wzrost entropii układu; jest potęgowana w roztworach o dużej sile jonowej. Złoża do chromatografii hydrofobowej FPLC Hydrophobic region Parametry próbki nanoszonej na kolumnę: środowisko buforu o dużej sile jonowej; Elucja: a/ bufor o zmniejszającej się sile jonowej; b/ gradient rozpuszczalnika organicznego (alkohole alifatyczne, aminy alifatyczne) lub detergentu niejonowego, np. Triton X-100

Chromatografia rozmiarów wykluczających Zasada: Porowate ziarna złoża z materiału całkowicie inertnego (Sephadex, Sepharose, Superose, Superdex, poliakrylamid. Pory w ziarnach o kontrolowanej średnicy. Cząsteczki białek, w zależności od swoich rozmiarów wnikają do porów (są zatrzymywane) lub przepływają obok. HiLoad Superdex 30, 75, and 200

Chromatografia rozmiarów wykluczających Najbardziej zachowawcza technika chromatograficzna stosowana do oczyszczania białek. Ograniczenie: objętość nanoszonej próbki powinna być jak najmniejsza Dowolny skład próbki nanoszonej na kolumnę Stosuje się kolumny długie, o niewielkiej średnicy Bardzo istotne jest dokładne, jednorodne upakowanie złoża w kolumnie Zależność szerokości pasma od objętości nanoszonej próbki Efekt dyfuzyjny

Chromatografia powinowactwa Podstawą separacji są wysoce selektywne, specyficzne oddziaływania białko: ligand związany trwale ze złożem. Ligandem może być np.: analog substratu, koenzymu, inhibitor kompetytywny, inhibitor allosteryczny Istnieje możliwość indywidualnego zaprojektowania i otrzymania złoża specyficznego wobec danego białka lub zakupu jednego z komercyjnie dostępnych kilkuset złóż o różnej specyficzności W niektórych przypadkach możliwe efektywne oczyszczenie białka w jednym etapie

Elucja: Można zastosować specyficzny eluent, zawierający kompetytor współzawodniczący o miejsca wiążące z ligandem. Na przykład plazminogen związany z unieruchomioną lizyną można odmyć kwasem ε-aminokapronowym, który - podobnie jak lizyna - jest inhibitorem plazminy, aktywnej formy plazminogenu. Zarówno kwas ε-aminokapronowy jak i lizyna wiążą się do tego samego miejsca w cząsteczce plazminogenu. Można jednak eluować związane substancje w sposób niespecyficzny, za pomocą buforów o niskiej lub wysokiej wartości pH (np. bufor octanowy, bufor węglanowy, itp.), roztworów o wysokiej sile jonowej (2,5 M roztwór NaCl), czy związków rozrywających wiązania wodorowe (4-8 M roztwór mocznika, 6 M roztwór guanidyny).

Zalety: - brak ograniczeń w stosunku do objętości nanoszonej na kolumnę próbki oraz do stężenia separowanego materiału w próbce - możliwość silnego zatężenia izolowanej molekuły - bardzo wysoka specyficzność - możliwość uzyskania w czystej postaci molekuł, które często nie mogą być izolowane innymi metodami wyizolowany materiał charakteryzuje się bardzo wysokim stopniem czystości pomimo zastosowania tylko jednego kroku preparatywnego. Wady: - trudności z uzyskaniem niektórych specyficznych ligandów - częsta konieczność przygotowania złoża we własnym zakresie - niska trwałość niektórych ligandów

Chromatografia powinowactwa Możliwości połączenia cząsteczek liganda ze złożem

Nośniki w chromatografii powinowactwa stosowane są złoża, które tradycyjnie wykorzystuje się do filtracji żelowej, z tym, że przed użyciem wymagają one odpowiedniej aktywacji. Są to pochodne dekstranowe (Sephadex), agarozowe (Sepharose) lub czasami poliakrylamidowe. Oprócz nośników, które można przygotować do celu chromatografii powinowactwa we własnym zakresie, dostępne są również złoża przystosowane już do chemicznego wiązania liganda, np. CNBr-Sepharose 4B.

Aktywacja nośnika Produkty aktywacji agarozy za pomocą CNBr

Chromatografia powinowactwa Przykładowe możliwości przytwierdzenia liganda do złoża

Chromatografia powinowactwa immobilizowanych barwników Analogia struktur przestrzennych cząsteczki Cibacron BlueF3GA (z lewej) i NAD (z prawej)

Chromatografia metalopowinowactwa Zasada: wiązanie białek posiadających liczne reszty aminokwasowe z elektrodonorowymi ugrupowaniami w łańcuchach bocznych (His, Arg, Trp, Cys) z jonami metalu: Co(II), Ni(II), Zn(II), Cu(II) lub Fe(II), Immobilizowanymi na złożu. Szczególnie przydatna dla izolacji białek posiadających struktury typu tzw. „palca cynkowego” oraz białek fuzyjnych z „ogonami poliHis”

GST tag

Chromatografia metalopowinowactwa Izolacja białka His6-SSB 1 – markery masy cząsteczkowej 2 – surowy lizat E. coli 3 – surowy lizat E. coli nadprodukujących His6-SSB 4 – eluat z kolumny Ni(II)-TED-Sepharose (elucja 0.5 M roztworem imidazolu)

CHROMATOGRAFIA KOWALENCYJNA Grupy czynne stosowanych wypełnień Zasada metody A/ Związanie B/ Elucja 2-tiopirydynon C/ Regeneracja

Immunochromatografia W celu izolacji enzymów lub innych białek: immunoadsorbent powstaje w wyniku przyłączenia do nośnika przeciwciał monoklonalnych rozpoznających dane białko

Planowanie procedury oczyszczania eznymu Kolejność etapów nie jest dowolna