Biofizyka makrocząsteczek Peptydy i białka Biofizyka makrocząsteczek

Biologiczne układy koloidalne

Układ koloidalny Układ koloidalny (koloid, układ koloidowy) – niejednorodna mieszanina, zwykle dwufazowa, tworząca układ dwóch substancji, w którym jedna z substancji jest rozproszona (zawieszona) w drugiej. Rozdrobnienie (czyli dyspersja) substancji rozproszonej jest tak duże, że fizycznie mieszanina sprawia wrażenie substancji jednorodnej, jednak nie jest to wymieszanie na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Właściwości W koloidach stopień dyspersji wynosi od 105 do 107 cm-1 – wówczas wielkość cząstek fazy zawieszonej (zdyspergowanej) sprawia, że ważne są zarówno oddziaływania pomiędzy nią i fazą dyspergującą, jak i oddziaływania wewnątrz obu faz. Układ dyspersyjny jest układem koloidalnym, gdy rozmiary cząstek fazy rozproszonej (cząsteczek chemicznych lub ich agregatów) albo rozmiary nieciągłości układu koloidalnego są w zakresie od 1 nm do 1 m przynajmniej w jednym kierunku.

Składniki układu koloidalnego Typowy układ koloidalny (tzw. koloid fazowy) składa się z dwu faz: fazy ciągłej, czyli substancji rozpraszającej, zwanej też ośrodkiem dyspersyjnym albo dyspergującym fazy rozproszonej, czyli substancji zawieszonej (zdyspergowanej) w ośrodku dyspersyjnym i w nim nierozpuszczalnej (liofobowej, hydrofobowej).

Koloidy cząsteczkowe koloidy cząsteczkowe, gdzie fazą rozproszoną są makrocząsteczki, np. polimery tj. żelatyna, skrobia, białka – nie występuje wówczas wyraźna granica fazowa, bo cząsteczki rozpuszczalnika mogą wnikać do wewnątrz makrocząsteczki większość koloidów cząsteczkowych powstaje w sposób samorzutny w wyniku rozpuszczania w rozpuszczalniku (koloidy liofilowe, hydrofilowe). Niektóre ich właściwości są inne niż właściwości koloidów fazowych.

Rodzaje układów koloidalnych Ośrodek rozpraszający Substancja rozpraszana Rodzaj Przykład Gaz – Ciecz aerozol ciekły mgła Ciało stałe aerozol stały dym piana piana mydlana emulsja lakier do paznokci, mleko, majonez zol, zawiesina koloidalna (suspensja), roztwór koloidalny Ag kol w H2O piana stała pumeks, styropian emulsja stała opal zol stały (pirozol) szkło rubinowe

Makrocząsteczki białkowe

Fizyczne metody badań dostarczają informacji na temat:

Fizyczne metody badań dostarczają informacji na temat: - struktury makrocząsteczek

Fizyczne metody badań dostarczają informacji na temat: - struktury makrocząsteczek - ich konformacji przestrzennej

Pojęcia podstawowe STRUKTURA – rozmieszczenie atomów w przestrzeni uporządkowane w sposób periodyczny

Pojęcia podstawowe STRUKTURA – rozmieszczenie atomów w przestrzeni uporządkowane w sposób periodyczny BAZA STRUKTURY – niezmienny zespół atomów, który periodycznie powtarzając się tworzy strukturę. Może składać się z jednego (w strukturach prostych) lub z wielu (w makrocząsteczkach) atomów

Poziomy uporządkowania struktury Wewnętrzny - bazy struktury

Poziomy uporządkowania struktury Wewnętrzny - bazy struktury Zewnętrzny - pomiędzy bazami

Pojęcia podstawowe KONFORMACJA(1) – względny rozkład atomów w przestrzeni wynikający z obrotu lub skręcenia wiązań kowalencyjnych

Pojęcia podstawowe KONFORMACJA(1) – względny rozkład atomów w przestrzeni wynikający z obrotu lub skręcenia wiązań kowalencyjnych KONFORMACJA(2) – przestrzenna struktura cząsteczki przy praktycznie stałych wartościach: długości wiązań, kątów między wiązaniami

Fizyczne metody badania makrocząsteczek metody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna),

Fizyczne metody badania makrocząsteczek metody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna), metody hydrodynamiczne,

Fizyczne metody badania makrocząsteczek metody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna), metody hydrodynamiczne, dyfuzja makrocząsteczek w roztworze,

Fizyczne metody badania makrocząsteczek metody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna), metody hydrodynamiczne, dyfuzja makrocząsteczek w roztworze, metody optyczne

Analiza rentgenostrukturalna Wykorzystuje zjawisko rozproszenia (dyfrakcji) promieni X przez kryształ

Analiza rentgenostrukturalna Wykorzystuje zjawisko rozproszenia (dyfrakcji) promieni X przez kryształ Dyfrakcję promieni X powodują tylko elektrony, stąd rentgenogram pozwala na uzyskanie mapy gęstości elektronowej

Analiza rentgenostrukturalna Wykorzystuje zjawisko rozproszenia (dyfrakcji) promieni X przez kryształ Dyfrakcję promieni X powodują tylko elektrony, stąd rentgenogram pozwala na uzyskanie mapy gęstości elektronowej Wymaga substancji oczyszczonych, jednorodnych, występujących w postaci krystalicznej

Analiza rentgenostrukturalna 4 Ryc. Schemat otrzymywania rentgenogramu: 1 – promień pierwotny, 2 – kryształ, 3 – promienie dyfrakcyjne, 4 - błona fotograficzna 1 2 3

Analiza rentgenostrukturalna Możliwa do zastosowania w badaniach struktur biologicznych dzięki zdolności do krystalizacji białek, kwasów nukleinowych i wirusów.

Analiza rentgenostrukturalna Atomy kryształu tworzą układy częściowo odbijających płaszczyzn – tzw. płaszczyzny sieciowe Ponieważ rozkład refleksów promieniowania x zależy od parametrów geometrycznych sieci krystalicznej, analizę rentgenostrukturalną wykorzystuje się do badania struktury kryształów nisko- i wysokocząsteczkowych

Analiza rentgenostrukturalna Ryc. Rentgenogram procesyjny oksyhemoglobiny ludzkiej wykonany w Zakładzie Krystalografii Instytutu Chemii UŁ.

Analiza rentgenostrukturalna Ryc. Fragment mapy gęstości elektronowej mioglobiny. Widoczne jest otoczenie hemu (wg. M.F.Perutz)

xj, yj, zj Analiza rentgenostrukturalna Parametry położenia atomów w strukturze xj, yj, zj

Parametry położenia atomów w strukturze Amplituda j-tego atomu: gdzie: fj – wielkość zależna od rodzaju atomu, a  - kąt fazowy zależny od pozycji atomu

Parametry położenia atomów w strukturze Amplituda promieni dyfrakcyjnych: gdzie: - moduł amplitudyFoblicza się z równania I = F2

Analiza rentgenostrukturalna Ryc. Odbicie promieni x od płaszczyzn sieciowych w krysztale

Analiza rentgenostrukturalna Ograniczenia: Długość fal x musi spełniać warunek Wulfa- Bragga: gdzie: λ – długość fali, m – rząd odbicia, θ – kąt pomiędzy kierunkiem padania promieni a płaszczyzną kryształu, d – odległość między sąsiednimi płaszczyznami sieciowymi

Analiza rentgenostrukturalna Ograniczenia: Warunek konieczny do spełnienia przez fale ulegające dyfrakcji na siatkach przestrzennych , tzn.

Analiza rentgenostrukturalna Ograniczenia: Warunek Wulfa-Bragga i długość fali różnych zakresów promieniowania elektromagnetycznego powodują, że kryształy przepuszczają promienie UV i Vis oraz uginają promienie x, γ oraz elektrony i neutrony.

Analiza rentgenostrukturalna METODA IZOMORFICZNYCH PODSTAWIEŃ: Jednoczesne wykorzystanie danych dyfrakcyjnych otrzymanych z kryształów kilku pochodnych oznaczanego związku

Metody hydrodynamiczne Dostarczają przybliżonych danych o wielkości i kształcie makromolekuł w oparciu o właściwości ich roztworów

Metody hydrodynamiczne Dostarczają przybliżonych danych o wielkości i kształcie makromolekuł w oparciu o właściwości ich roztworów Są mniej dokładne, ale łatwiejsze do wykonania od metod rentgenograficznych

Metody hydrodynamiczne lepkość,

Metody hydrodynamiczne lepkość, dyfuzja makrocząsteczek w roztworze,

Metody hydrodynamiczne lepkość, dyfuzja makrocząsteczek w roztworze, sedymentacja w wirówce.

Lepkość – gradient prędkości cząsteczek w cieczy rzeczywistej Ryc. Zachowanie się makrocząsteczki w cieczy, w której występuje gradient prędkości: a – prędkości warstw cieczy względem nieruchomego układu odniesienia, b – prędkość cieczy względem makrocząsteczki M

Lepkość – siły wprawiające w ruch obrotowy makrocząsteczki, którego utrzymanie wymaga dodatkowej energii, pochodzącej ze wzrostu lepkości roztworu Ryc. Pary sił działające na cząsteczki o różnych kształtach w gradiencie prędkości cieczy

Lepkość dla cząsteczek kulistych (równanie Einsteina) gdzie 0 – lepkość rozpuszczalnika, a  - stosunek objętości cząsteczki do objętości całego roztworu

Lepkość dla cząsteczek kulistych (równanie Einsteina) gdzie 0 – lepkość rozpuszczalnika, a  - stosunek objętości cząsteczki do objętości całego roztworu dla cząsteczek o innych kształtach lepkość wzrasta co można wykorzystać do określania przybliżonego kształtu makromolekuł

Dyfuzja makrocząsteczek w roztworze Wykorzystuje zależność współczynnika dyfuzji od kształtu i rozmiaru makrocząsteczek gdzie: NA – liczba cząsteczek w jednym molu substancji, η- lepkość i r – promień cząsteczki.

Sedymentacja w wirówce Sedymentacja - osiadanie cząsteczek zawieszonych w ośrodku dyspersyjnym (rozpuszczalniku) w polu grawitacyjnym lub odśrodkowym

Sedymentacja w wirówce Rotor Przeciwwaga Kuweta analityczna Oś obrotu Badany roztwór X Ryc. Schemat rotora wirówki analitycznej

Sedymentacja w wirówce Umożliwia wyznaczenie mas molowych w oparciu o równanie Svenberga gdzie:  - gęstość rozpuszczalnika współczynnik sedymentacji: , przyspieszenie jednostkowe: , stosunek objętości cząsteczki do jej masy

Metody optyczne Rozpraszanie światłą (efekt Tyndalla)

Metody optyczne Rozpraszanie światłą (efekt Tyndalla) Rozpraszanie promieni Rentgena

Metody optyczne Rozpraszanie światłą (efekt Tyndalla) Rozpraszanie promieni Rentgena Metody spektrofotometryczne

Poziomy organizacji cząsteczki białka Struktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów)

Poziomy organizacji cząsteczki białka Struktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów) Struktura drugorzędowa (układ przestrzenny głównego łańcucha polipeptydowego, np. -helix, struktura )

Poziomy organizacji cząsteczki białka Struktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów) Struktura drugorzędowa (układ przestrzenny głównego łańcucha polipeptydowego, np. -helix, struktura ) Struktura trzeciorzędowa (sposób zwinięcia w przestrzeni łańcucha o określonej strukturze drugorzędowej)

Poziomy organizacji cząsteczki białka Struktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów) Struktura drugorzędowa (układ przestrzenny głównego łańcucha polipeptydowego, np. -helix, struktura ) Struktura trzeciorzędowa (sposób zwinięcia w przestrzeni łańcucha o określonej strukturze drugorzędowej) Struktura czwartorzędowa (układ przestrzenny podjednostek oraz zespół oddziaływań i kontaktó między nimi

Poziomy organizacji cząsteczki białka

Geometria wiązania peptydowego a. Sprzężenie wiązań i częściowe pokrywanie się powłok elektronowych a. Wymiary kątów i poszczególnych wiązań w ugrupowaniu peptydowym

Geometria wiązania peptydowego

Mechanizm sprzęgania wiązań +

Cechy wiązania peptydowego Podwójny charakter wiązań C’ = N umożliwia swobodną rotację atomów, która wymaga jednak pewnych nakładów energii. Kąt obrotu wokół C’ = N, czyli kąt deformacji oznaczany jest symbolem 

Cechy wiązania peptydowego Podwójny charakter wiązań C’ = N umożliwia swobodną rotację atomów, która wymaga jednak pewnych nakładów energii. Kąt obrotu wokół C’ = N, czyli kąt deformacji oznaczany jest symbolem  Polarność ugrupowania peptydowego stwarza możliwość występowania konfiguracji cis i trans. Konfiguracja trans jest korzystniejsza energetycznie i bardziej typowa dla otwartych łańcuchów peptydowych

Cechy wiązania peptydowego Podwójny charakter wiązań C’ = N umożliwia swobodną rotację atomów, która wymaga jednak pewnych nakładów energii. Kąt obrotu wokół C’ = N, czyli kąt deformacji oznaczany jest symbolem  Polarność ugrupowania peptydowego stwarza możliwość występowania konfiguracji cis i trans. Konfiguracja trans jest korzystniejsza energetycznie i bardziej typowa dla otwartych łańcuchów peptydowych Ugrupowania peptydowe mogą się ze sobą łączyć wiązaniami wodorowymi

Konformacja polipeptydów (założenie podstawowe) Cząsteczki w stanie równowagi termodynamicznej przyjmują konformację najbardziej korzystną energetycznie

Konformacja polipeptydów (założenie podstawowe) Cząsteczki w stanie równowagi termodynamicznej przyjmują konformację najbardziej korzystną energetycznie Konformację prostych związków organicznych można ustalić w oparciu o mechanikę kwantową

Konformacja polipeptydów (założenia podstawowe) Cząsteczki w stanie równowagi termodynamicznej przyjmują konformację najbardziej korzystną energetycznie Konformację prostych związków organicznych można ustalić w oparciu o mechanikę kwantową Celem ustalenia konformacji makrocząsteczek (np. białek), ze względu na ich złożoność, stosuje się metody półempiryczne

Energia potencjalna polipeptydu Vn – suma energii oddziaływań van der Wallsa, Vt – energia oddziaływania torsyjnego (orientacji wiązań), Vel – energia oddziaływań elektrostatycznych, VH – energia tworzenia wiązania wodorowego, VW, Vk – energia deformacji długości i kątów wiązań, Vhydr – energia hydratacji.

Warunki trwałości konformacji łańcucha peptydowego (Pouling, Carey i Branson 1951) Wszystkie aminokwasy wchodzące w skład łańcucha peptydowego muszą należeć do tego samego szeregu konfiguracyjnego Każda wiązanie peptydowe ma konformację płaską (koplanarną) o parametrach typowych dla związków niskocząsteczkowych

Warunki trwałości konformacji łańcucha peptydowego (Pouling, Carey i Branson 1951) Grupy C’ = O i N – H tworzą wewnętrzne wiązania wodorowe o długości 0,272nm, odchylające się od lini prostej o kąt nie większy od 30º Ustawienie przestrzenne wiązań C’ – C i C – N odpowiada odpowiada minimalnej energii obrotu wokół tych wiązań

Konformacje polipeptydów (a) Heliks- (b) Struktura-

Konformacje helikalne HELIX - : 5,1 reszt aminokwasowych na 1 zwój; kąt odchylenia wiązania wodorowego od osi heliksu wynosi 10º

Konformacje helikalne HELIX - : 5,1 reszt aminokwasowych na 1 zwój; kąt odchylenia wiązania wodorowego od osi heliksu wynosi 10º HELIX - : 3,6 reszt aminokwasowych na 1 zwój; kąt odchylenia wiązania wodorowego od osi heliksu wynosi 10º

Charakterystyka  - heliksu Średnica heliksu wynosi 1,01 nm

Charakterystyka  - heliksu Średnica heliksu wynosi 1,01 nm Odległości między skrętami wynoszą 0,54 nm

Charakterystyka  - heliksu Średnica heliksu wynosi 1,01 nm Odległości między skrętami wynoszą 0,54 nm Translacja (tzn. przesunięcie wzdłuż osi o 1 resztę aminokwasową wynosi 0,15 nm

Charakterystyka  - heliksu Średnica heliksu wynosi 1,01 nm Odległości między skrętami wynoszą 0,54 nm Translacja (tzn. przesunięcie wzdłuż osi o 1 resztę aminokwasową wynosi 0,15 nm Może być prawo- (dla D-aminokwasów) lub lewoskrętny (dla L-aminokwasów)

Prawo- i lewo-skrętny -heliks

Rodzaje struktury  Struktura  Równoległa

Rodzaje struktury  Struktura  Równoległa Antyrównoległa

Rodzaje struktury  Struktura  Równoległa Antyrównoległa -cross

Struktura  równoległa antyrównoległa

Struktura -cross

Charakterystyka struktury -  Struktura warstwowa, zbudowana z położonych obok siebie łańcuchów peptydowych

Charakterystyka struktury -  Struktura warstwowa, zbudowana z położonych obok siebie łańcuchów peptydowych Wiązania wodorowe powstają między ugrupowaniami peptydowymi sąsiednich łańcuchów

Charakterystyka struktury -  Struktura warstwowa, zbudowana z położonych obok siebie łańcuchów peptydowych Wiązania wodorowe powstają między ugrupowaniami peptydowymi sąsiednich łańcuchów W strukturze -cross wiązania wodorowe powstają zarówno między ugrupowaniami peptydowymi sąsiednich łańcuchów jak i w obrębie tego samego łańcucha

Struktura kolagenu

Charakterystyka struktury kolagenu Jednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu

Charakterystyka struktury kolagenu Jednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu Parametry pojedynczego heliksu: promień heliksu 0,1 nm; skok 0,251 nm przy 3 resztach aminokwasowych na zwój

Charakterystyka struktury kolagenu Jednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu Parametry pojedynczego heliksu: promień heliksu 0,1 nm; skok 0,251 nm przy 3 resztach aminokwasowych na zwój Wiązania wodorowe występują tylko między łańcuchami polipeptydowymi w liczbie 1 mostek na 3 jednostki peptydowe

Charakterystyka struktury kolagenu Jednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu Parametry pojedynczego heliksu: promień heliksu 0,1 nm; skok 0,251 nm przy 3 resztach aminokwasowych na zwój Wiązania wodorowe występują tylko między łańcuchami polipeptydowymi w liczbie 1 mostek na 3 jednostki peptydowe Małe heliksy skręcają się wokół wspólnej osi tworząc duży prawoskrętny heliks

Parametry konformacji helikalnych peptydów Pierścień Heliks- prawoskrętny Heliks- prawoskrętny Płaska wstęga Heliks- lewoskrętny n – liczba reszt aminokwasowych na 1 zwój h(d) – translacja wzdłuż osi heliksu na 1 resztę aminokwasową p – odległość między sąsiednimi skrętami mierzona wzdłuż osi heliksu

Parametry konformacji peptydów – kąty rotacji wokół pojedyńczych wiązań  - kąt rotacji wokół wiązania N - C   - kąt rotacji wokół wiązania C - C  - kąt rotacji wokół wiązania N – C  = 0  - kąt rotacji wokół wiązania N – C przyjmuje wartości  0º lub 180º W łańcuchu rozciągniętym zachodzi równość:  =  =  = 180º

Mapa konformacyjna wg. Ramachandrana

Mapa konformacyjna wg. Ramachandrana c.d.