METODA LOSOWEJ AMPLIFIKACJI POLIMORFICZNEGO DNA (RAPD) Ilona Warzecha, Jakub Skorupski

DEFINICJA I ZASADA METODY Metoda losowej amplifikacji polimorficznego DNA (ang. randomly amplified polymorphic DNA) - odmiana techniki PCR (RAPD-PCR), polegająca na losowej amplifikacji fragmentów DNA o różnej długości z użyciem arbitralnie wybranego krótkiego startera, wykazującego komplementarność do wielu miejsc w obrębie danego genomu. Użycie takiego startera generuje amplifikację pewnej liczby fragmentów o różnej długości, w zależności od gatunku, odmiany, osobnika. Utworzenie amplikonów o różnej długości daje mozliwość stosunkowo prostej wizualizacji, interpretacji i analizy uzyskanych wyników przy pomocy standardowej techniki elektroforetycznej.

PRZEBIEG I CECHY CHARAKTERYSTYCZNE Na przebieg metody RAPD składa się zbliżona do PCR amplifikacja oraz wizualizacja i interpretacja wyników za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym lub poliakryloamidowym. ryc. 1. Schematyczny przebieg metody RAPD (polimorficzny locus B).

Różnice pomiędzy standardowym PCR a techniką RAPD polegają na: wykorzystaniu tylko jednego, startera o przypadkowej sekwencji (ang. arbitrary primer), inicjującego elongację obu nici amplifikowanego fragmentu; starter ma długość kilku do kilkunastu nukleotydów (10 - 20) i zawiera 50-80% zasad G i C; niższej temperatury przyłączania startera do matrycowego DNA (ok. 35 st. C), skutkującej mniejszą specyficzność wiązania krótkiego primera oraz umożliwiającą stabilność elongację; większej liczbie cykli reakcji (40-50). Cechami charakterystycznymi metody RAPD są również: - substytucje, insercje i delecje; - wymagana wyjściową ilość DNA - 10-25 ng.

ZASTOSOWANIE TECHNIKI RAPD 1) ocena pokrewieństwa między organizmami, zarówno na poziomie organizmalnym (identyfikacja poszczególnych osobników tego samego gatunku, szczepów, linii lub odmian), jak również jednostek systematycznych wyższego rzędu (konstrukcja drzew filogenetycznych, badanie pokrewieństwa ewolucyjnego); 2) opracowywanie specyficznych markerów genetycznych powiązanych z cechami o szczególnym znaczeniu praktycznym (tzw. markery SCAR, ang. sequence characterized amplified region), 3) uzyskiwanie sond molekularnych umożliwiających jednoznaczną identyfikację określonego szczepu (lub każdej innej jednostki systematycznej).

Do zalet metody RAPD należy: możliwość wychwycenia zmienności genetycznej bez potrzeby znajomości sekwencji analizowanego DNA, - amplifikacja sekwencji wielu loci genomu podczas pojedynczej reakcji; niewielka długość stosowanych starterów pozwala spodziewać się istnienia w badanym genomie wielu sekwencji komplementarnych, - brak potrzeby posiadania zaawansowanych umiejętności manualnych, - szybkość analizy (kilka godzin), - nieduże wymagania sprzętowe (termocykler, aparat elektroforetyczny), - mało specyficzne warunki reakcji zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia kilku do kilkunastu prążków na elektroforogramie, co ułatwia interpretację wyników i dalszą analizę - niski koszt analizy, - możliwość wychwycenia różnic genetycznych przy średnim poziomie polimorfizmu, - alternatywa dla bardziej czaso- i kosztochłonnej techniki RFLP, również stosowanej w badaniach polimorfizmu genów.

Wśród wad techniki RAPD wymienia się: brak możliwości rozpoznania homozygoty dominującej od heterozygoty (podwojenie kopii matrycy nie wpływa znacząco na intensywność prążka), słaba powtarzalność uzyskanych wyników, spowodowana bardzo dużą wrażliwość metody na zmiany warunków amplifikacji.

LITERATURA Charon K. M., Świtoński M. Genetyka zwierząt. PWN. 2004. Warszawa. s. 80, Joachimiak A. Genetyka. Małopolska Oficyna Wydawnicza "KORONA". 1997. Kraków. s. 120. Przykłady analiz DNA. Pod red. R. Słomskiego. Wyd. AR im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu. 2004. Poznań. ss. 185-197. http://images.google.pl/imgres?imgurl=http://www.informatics.jax.org/silver/images/figure8-9.gif&imgrefurl= http://www.informatics.jax.org/silver/figures/figure8-9.shtml&h=401&w=650&sz=14&hl=pl&start=28&tbnid=Rt6lZewbrGSgxM:&tbnh=85&tbnw=137&prev=/images%3Fq%3Drapd%26start%3D20%26ndsp%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dpl%26lr%3D%26sa%3DN.