RNA i transkrypcja u eukariontów

Rodzaje sekwencji w DNA (sekwencje kodujące w genomie człowieka – 0,015% (+niekodujące sekwencje regulatorowe – promotory/enhancery/izolatory) Single copy genes Kodujące

Rozmieszczenie sekwencji w chromosomach Konstytutywna heterochro- matyna

Rozproszone rodziny genowe Ludzkie geny globinowe typu α i β Ψ - pseudogeny ξ,ε,γ -globiny płodowe

Zwarte rodziny genowe Geny kodujące histony w genomie Drosophila a, b, c, d, e – krótkie sekwencje rozdzielajace poszczególne geny

Geny nieciągłe Sens biologiczny intronów? Początek pierwszego eksonu (5’ koniec mRNA) Kraniec ostatniego eksonu (3’ koniec mRNA) Zawartość genów nieciągłych: Drożdże – 5% (ale 26% wszystkich transkryptów) Rośliny i zwierzęta – większość genów ( ≥ 85%) Sens biologiczny intronów? 60% genów ludzkich – alternatywny splicing Gen Dystrofiny (dystrofia mięśniowa Duchenne’a) – 75 intronów 2,5 mln pz.; Eksony – 11 000 pz. (0,5% genu) Długość intronów: 31 pz (SV-40) – 210 000 pz (Dystrofina)

Transkrypcja w komórce eukariotycznej Transkrypt – kopia nici matrycowej DNA o sekwencji Identycznej z sekwencją nici kodującej DNA Trzy fazy transkrypcji: inicjacja, elongacja, terminacja Podstawowe elementy systemu transkrypcji: polimerazy RNA czynniki transkrypcyjne sekwencje regulatorowe w DNA

Bakteryjna polimeraza RNA Białko o masie ok.480 kd Cztery podjednostki: alfa (α), beta (β), beta’ (β‘) i sigma (δ); tylko pierwsze trzy niezbędne do aktywności enzymatycznej (rdzeń polimerazy) Czynnik sigma niezbędny dla wiązania RNA polimerazy do promotora; enzym ma ogólne powinowactwo do DNA, w obecności czynnika sigma wiąże się jednak wyłącznie do promotora.

Eukariotyczna Polimeraza RNA Cztery typy Mitochondrialna – 1 (u roślin także – chloroplastowa) Jądrowe: - 3 Typ Produkt Lokalizacja Budowa α-amanityna RNA Polymerase I rRNA jąderko Podjedn. Niewrażliwa RNA Polymerase II hnRNA nukleoplazma Podjedn. B. wrażliwa snRNA (splicing) RNA Polymerase III tRNA nukleoplazma Podjedn. Umiark. wrażliwa 5S rRNA Masa Pol II ponad 500 kd Dwie duże podjednostki; ok. 10 małych podjednostek; największa podjednostka: homologiczna do β', następna co do wielkości – do β. Dla wiązania się z DNA potrzeba wielu czynników nie należących do kompleksu polimerazy

Polimerazy RNA Prokarionty Eukarionty Homlogi Homologi

Transkrypcja u bakterii - inicjacja

Transkrypcja u bakterii - elongacja

Promotor u prokariontów

Sekwencje regulatorowe Pol II Eukarionty

Sekwencje regulatorowe Pol I i Pol III Pol I – promotor dwuskładnikowy -107 do -180 -45 do +20 Pol III – dwa typy promotorów Zewnętrzny (zawiera TATA) Wewnętrzny +55 do +80 5s rRNA snRNA

Składniki kompleksu transkrypcyjnego A) Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF) – takie same dla wszystkich genów transkrybowanych przez daną polimerazę RNA - wraz z polimerazą stanowią tzw. „Podstawowy Aparat Transkrypcyjny”, wiążą się do sekwencji w obrębie bliskiego promotora i miejsca startu transkrypcji. B) Aktywatory – Czynniki Transkrypcyjne (TF) oddziałujące bezpośrednio z DNA, wiążą się do sekwencji dalszego promotora i sekwencji w enhancerach. C) Koaktywatory i Korepresory – białka nie oddziałujące bezpośrednio z DNA, stanowią ogniwo pośrednie umożliwiające oddziaływania między TF związanymi z dalszym promotorem i enhancerami a Podstawowym Aparatem Transkrypcyjnym.

Porównanie inicjacji transkrypcji u pro- i eukariontów

Sekwencje w promotorze Pol II

Czynnik transkrypcyjny AP1 ma domenę z motywem suwaka leucynowego

Suwak leucynowy

Czynnik transkrypcyjny Sp1 ma domenę z motywem palców cynkowych

Motyw palców cynkowych

Czynniki transkrypcyjne z motywem H-T-H (Helix-Turn-Helix)

Oddziaływanie z DNA warunkuje interakcje

Inicjacja transkrypcji Pol II TFIID

Inicjacja transkrypcji Pol II- budowa TFIID TBP – TATA-Binding Protein TAF - TBP-Associated Factors GTF – General Transcription Factor

Działanie enhancerów

Drożdżowy system dwuhybrydowy

Enhancery działają na odległość

Funkcja i rozmieszczenie izolatorów

Komplikowanie się obrazu transkrypcji Pol II

Szczeble regulacji transkrypcji

Dodawanie czapeczki na 5’ końcu transkryptu

Sekwencje rozpoznawane przez system splicingu

Mechanizm splicingu

Splicing alternatywny

Poliadenylacja 3’ końca mRNA

Struktura 3’ szpilki w mRNA histonów

NMD- Nonsense-Mediated Decay System degradacji nieprawidłowych mRNA, zawierających PTC (Premature Terminantion Codon) - przedwczesne kodony terminacyjne translacji Ścieżka NMD wywiera bezpośredni wpływ na setki zaburzeń genetycznych w populacji ludzkiej. ¼ wszystkich znanych mutacji u człowieka indukuje NMD