Świat małych RNA

Czym są małe RNA? Małe RNA to populacja cząsteczek RNA o długości 21 to 24 nt, które generalnie powodują wyciszanie genów (gene silencing) Małe RNA przyczyniają się do potranskrypcyjnego wyciszania genów (post-transcriptional gene silencing-PTGS) poprzez negatywne działanie na translację lub stabilność mRNA Małe RNA przyczyniają się do transkrypcyjnego wyciszania genów (transcriptional gene silencing- TGS) poprzez epigenetyczne modyfikacje chromatyny AAAAA RNA Pol Modyfikacje histonów, metylacja DNA

Podstawa wyciszania przez RNA – białka Dicer i Argonaute Wyciszanie przez RNA opiera się na dwóch podstawowych reakcjach: a) Dwuniciowy RNA (dsRNA) jest rozcinany przez Dicer i jego homologi na krótkie dwuniciowe RNA. b) Te małe RNA asocjują następnie z białkami rodziny ARGONAUTE i powodują wyciszenie. DICER AGO Silencing

Dicer i białka podobne do Dicer From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi Heidi Struktura Dicera pozwala mu mierzyć RNA, który rozcina. Podobnie jak kucharz szatkujący marchewkę, Dicer tnie RNA na równe fragmenty. W biogenezie siRNA i miRNA, Dicer lub białka podobne do Dicer (Dicer-like – DCL proteins) rozcinają dsRNA lub RNA ze spinką (hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25 nt.

Białka Argonaute Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – with permission of AAAS.170– – 1437 Białka ARGONAUTE wiążą małe RNA i ich cele Mutant Arabidopsis ago1 i ośmiornica Argonauta argo Białka ARGONAUTE nazwano tak ze względu na wygląd mutanta Arabidopsis argonaute1 ; ago1 ma promieniście rozłożone liście przez co przypomina ośmiornicę o nazwie Argonauta.

Wyciszanie przez RNA – obraz ogólny DCL MIR gene RNA Pol AAAn AGO AAAn RNA Pol MicroRNA – działa poprzez wyciszanie mRNA i represję translacji mRNA AAAn AGO DCL AGO AAAn AGO RNA Pol AGO siRNA - działa poprzez potranskrypcyjne i transkrypcyjne wyciszanie genów AGO AAAn

siRNA – Ochrona genomu siRNA chronią genom poprzez: Supresję atakujących komórkę wirusów Wyciszanie źródeł wadliwych transkryptów Wyciszanie transpozonów i elementów powtarzających się Oprócz tego, siRNA utrzymują niektóre geny w stanie epigenetycznie wyciszonym Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature. Lam, E., Kato, N., and Lawton, M. (2001) Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. Nature 411: Copyright

Wyciszanie genów indukowane przez wirusy – obraz ogólny AGO Większość wirusów roślin to RNA wirusy, które replikują się poprzez dwuniciowe formy pośrednie. DCL Wirusowy ssRNA Wirusowy dsRNA Kodowana przez wirusa RNA- zależna RNA polimeraza AGO Dwuniciowy RNA jest rozcinany przez DCL wytwarzając siRNA, które asocjują z AGO wyciszając replikację i ekspresję wirusa.

Rośliny mogą obronić się przed infekcją wirusem i nabyć oporności Młodsze liście wytwarzane przez roślinę zakażoną wirusem mogą być pozbawione infekcji, co wskazuje, że rosnąca roślina obroniła się przed infekcją. NajstarszeNajmłodsze Inokulacja wirusem

Małe RNA korelują z indukowanym przez infekcję wirusem wyciszeniem genów Mały RNA homologiczny do wirusowego RNA występuje w liściachinokulowanych i odległych młodych liściach (systemic leaf), ale nie w liściach inokulowanych roztworem bez wirusa (mock), Inokulowany liść Młody liść (syst.leaf) Dni po inokulacji From Ratcliff, F., Henderson, B.D., and Baulcombe, D.C. (1997) A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: 1558–1560. Reprinted with permission from AAAS.1558–1560

Infekcja wirusem powoduje systemiczną akumulację siRNA DCL Liść inokulowany Odległy liść AGO

Wyciszenie może się rozprzestrzeniać systemicznie poprzez floem Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature Copyright Voinnet, O., and Baulcombe, D. (1997) Systemic silencing in gene silencing. Nature 389: Inokulowany liść Systemiczne wyciszenie Sygnałem systemicznym jest siRNA

Mutanty w wytwarzaniu siRNA są bardziej podatne na infekcje wirusowe From Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K., Carrington, J.C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313: 68–71. Reprinted with permission from AAAS.68–71 Dzikie rośliny Arabidopsis inokulowane TRV Podwójny mutant dcl2- dcl4 inokulowany TRV Wyciszanie wirusa TRV w dzikich roślinach Arabidopsis zapobiega występowaniu symptomów choroby. Mutanty pozbawione aktywności Dicer są niezdolne do powstrzymania infekcji.

Wirusy maja białka supresorowe, które zapobiegają wyciszeniu RNA DCL RdRP DCL Poprzez zakłócenie procesu wyciszania RNA wirusowe białka supresorowe zakłócają mechanizm obrony rośliny przed wirusami. Supresory mogą działać na każdym etapie wytwarzania i funkcjonowania siRNA.

Małe RNA chronią także rośliny przed patogenami bakteryjnymi Reprinted from Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and Voinnet, O. (2008) Suppression of the microRNA pathway by bacterial effector proteins. (2008) Science 321: Reprinted with permission from AAAS Rośliny dzikie (La-er) i mutanty w wytwarzaniu małych RNA (dcl1-9 and hen1- 1) inokulowane bakteriami Pseudomonas.

Wyciszanie indukowane przez wirusy - podsumowanie Wyciszanie genów za pośrednictwem RNA jest ważnym narzędziem w obronie roślin przed patogenami. siRNA zakłócają replikację wirusów. siRNA działają systemicznie wspomagając obronę przed wirusami i oporność roślin. Większość wirusów wytwarza białka supresorowe procesu wyciszania RNA. Białka te stanowią ważne narzędzie w badaniu szlaków wyciszania RNA.

Wyciszanie transgenów Transgeny wprowadzone do roślin są często wyciszane przez szlak siRNA. Wyciszenie może być zaindukowane przez: Bardzo wysoki poziom ekspresji dsRNA pochdzące z transgenu Nietypowe RNA kodowane przez transgen Transgeny są wyciszane potranskrypcyjnie i transkrypcyjnie.

Wyciszanie indukowane przez transgeny Photo credits: Martha Hawes, University of Arizona. W latach 1980-tych opracowano metodę wprowadzania genów do genomów roślinnych za pomocą bakterii Agrobacterium tumefaciens. Wprowadzone geny noszą nazwe transgenów. Komórka roślinna Jądro DNA Agrobacterium tumefaciens na powierzchni komórki

Indukowane przez transgeny wyciszanie potranskrypcyjne Doświadczenia nad modyfikacją koloru kwiatów petuni dostarczyły pierwszych dowodów na wyciszanie RNA.

Manipulacje ekspresją syntazy chalkonowej w celu modyfikacji pigmentacji kwiatów Dzika roślina petuni wytwarza purpurowe barwniki antocjanowe Syntaza chalkonowa (CHS) jest enzymem działającym na początku szlaku syntezy antocjanów Photo credit Richard Jorgensen; Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology :25 doi: / Richard Jorgensen Antocjany Syntaza chalkonow a (CHS)

Spodziewane – produkcja sensownego RNA syntazy chalkonowej (CHS) zwiększy pigmentację... Sensowny RNA Sense construct: PROORF Gen własny mRNA Transgen PROORF mRNA Translacja białka mRNA Dodatkowa translacja białka

.. a produkcja antysensownego RNA zablokuje pigmentację Sensowny RNA Antysensow ny RNA Konstrukt sensowny: PROORF Gen wlasny mRNA Transgen PROORF mRNA Translacja białka mRNA Dodatkowa translacja białka Konstrukt antysensowny: PRO ORF Transgen Tworzy się dupleks sens-antysens, który hamuje translację

Nieoczekiwanie, zarówno antysensowny jak i sensowny konstrukt hamował wytwarzanie pigmentu Photo credit Richard JorgensenRichard Jorgensen Rośliny z transgenem CHS CaMV 35S pro : CHS CaMV 35S pro : CHS SensAntysens OR

Wyciszone tkanki nie wyrażają ani własnego ani wprowadzonego genu CHS Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279– –289. RNA transgenu RNA własnego genu Purpurow e kwiaty Białe kwiaty To zjawisko, w którym zarówno wprowadzony, jak i własny gen ulegają wyciszeniu, nazwano kosupresją.

Kosupresja jest rezultatem wytwarzania siRNA De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia. RNA 15: 1965– –1970 PROORF Dzika mRNA Translacja białka Własny gen Sens RNA Sense construct Transgeniczna z kosupresją PROORF Kosupresja PROORF Własny gen mRNA AGO AAAA AGO AAAA AGO siRNA jest wytwarzany

Najsilniejszym induktorem wyciszania RNA jest dwuniciowy RNA, co wykazano w badaniach na C. elegans Derived The Nobel Committee based on Fire, A. et al., (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: The Nobel Committee Senowny RNA Antysensowny RNA Dwuniciowy RNA Brak efektu Nieskoordynowane skurcze Sensowny, antysensowny i dwuniciowy RNA homologiczny do genu unc-22 wprowadzono do C. elegans. Wyciszenie unc-22 powoduje utrate kontroli nad mięśniami, stąd nazwa unc od ang.uncoordinated.

Transkrypcyjne wyciszanie genów Małe RNA mogą inicjować wyciszanie DNA poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub zasocjowanych z nim histonów, zakłócając w ten sposób transkrypcję. Transkrypcja Ta forma wyciszania występuje często na stabilnie wyciszonym DNA i dotyczy np. centromerów i transpozonów, ale niekiedy dotyczy także genów. DNA Białka histonowe Wyciszanie

Transkrypcyjne wyciszanie genów Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8: CaMV 35S pro : KANCaMV 35S pro : HYG Transkrypcyjne wyciszanie genów ujawniły doświadczenia, w których do roślin poprzez krzyżówki genetyczne wprowadzono więcej niż jeden transgen. Ekspresja genu, który niesie oporność na antybiotyk kanamycynę Ekspresja genu, który niesie oporność na antybiotyk higromycynę

siRNA mogą wskazywać DNA do wyciszenia poprzez metylację cytozyny lub za pośrednictwem enzymów modyfikujących histony O N NH 2 N ~ O N N ~ CH3 cytozyna5-metylocytozyna Metylotransferaza DNA może być kowalencyjnie modyfikowany przez metylację cytozyny dokonywaną przez DNA- metylotransferazy. Metylacja DNA Dokładne mechanizmy, za pomocą których siRNA wskazują DNA do wyciszenia nie są znane, ale wiadomo, że wymagają działania dwóch specyficznych dla roślin kompleksów RNA-polimeraz: RNA Polimerazy IV (Pol IV) i RNA Polimerazy V (Pol V). AGO DNA methyltransferase Modyfikacja histonów

Rośliny zawierają dodatkowe kompleksy RNA polimeraz, które biorą udział w wyciszaniu KompleksWystępowanieFunkcja RNA Polimeraza IWszystkie eukariotaProdukcja rRNA RNA Polimeraza IIWszystkie eukariotaProdukcja mRNA, microRNA RNA Polimeraza IIIWszystkie eukariotaProdukcja tRNA, 5S rRNA RNA Polimeraza IVRośliny lądoweProdukcja siRNA RNA Polimeraza VRośliny nasienneRekrutacja AGO do DNA DNA RNA RNA Polimeraza

Większość siRNAs wytwarzana jest z transpozonów i powtarzalnego DNA Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C. (2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57.e57 Większość komórkowych siRNA pochodzi z transpozonów i innych powtarzalnych sekwencji. U Arabidopsis, (schemat powyżej) sekwencje te występują z wielką częstością w pericentromerycznych rejonach chromosomów. Ilość małych RNA Ilość transpozonów/ retrotranspozonó w Chromosom Centromer

siRNA - podsumowanie Szlak siRNA wycisza obce DNA, transpozony i sekwencje powtarzalne. U roślin, siRNA są wytwarzane przez białka podobne do Dicer rozcinające dsRNA na 24 nt siRNA. siRNA asocjuja z białkami AGO, z którymi tworzą kompleksy wyciszające. Kompleksy wyciszające mogą działać potranskrypcyjnie na docelowe RNA, przecinając je lub zakłócając ich translację. Kompleksy wyciszające mogą również działać na chromatynę, wyciszając docelowe DNA przez metylację lub modyfikacje zasocjowanych z nim histonów.

microRNA - miRNA miRNA prawdopodobnie wyewoluowały z siRNA, oba te rodzaje małych RNA są wytwarzane i obrabiane w podobny sposób. U roślin występuje niewielka liczba silnie konserwowanych miRNA oraz duża liczba nie konserwowanych miRNA. miRNA są kodowane przez specyficzne geny MIR, ale same działają na inne geny – sa czynnikami regulatorowymi działającymi w trans. U roślin miRNA regulują przede wszystkim rozwój i odpowiedzi fizjologiczne

microRNA - miRNA AAAn RNA Pol II microRNA przecinają mRNA lub zakłócają ich translację DCL Gen MIR RNA Pol II mRNA AAAn AGO AAAn AGO Zakłócanie translacji Przecina nie mRNA

miRNA i siRNA podlegają obróbce przez pokrewne, ale odmienne białka DCL Reprinted from Margis, R., Fusaro, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J., and Waterhouse, P.M. (2006) The evolution and diversification of Dicers in plants FEBS Lett. 580: with permission from Elsevier W roślinach występuje 4 lub więcej białek DCL, więcej niż w jakichkolwiek innych organizmach. Zwiększona różnorodność i liczba białek DCL ma prawdopodobnie związek z rozbudowanym systemem ochrony przed patogenami. AtDCL1 wytwarza miRNA AtDCL2 - 4 wytwarza siRNA DCL4 DCL1

miRNA i siRNA asocjują z kilkoma białkami AGO AGO1 AGO4 AGO1 preferencyjnie przecina sekwencje docelowe, asocjuje z miRNA, ale także z niektórymi siRNA AGO4 preferencyjnie asocjuje z siRNA i pośredniczy w metylalcji docelowego DNA. W Arabidopsis występuje 10 białek AGO. Nie są zbyt dobrze zcharaktery- zowane. Ich funkcje częściowo się nakładają Reprinted from Vaucheret, H. (2008) Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci. 13: with permission from Elsevier

Geny MIR są transkrybowane jako długie RNA, które są przekształcane w miRNA miRNA sa kodoane przez geny MIR Pierwotny transkrypt miRNA (pri- miRNA) składa się w strukturę dwuniciową, która podlega obróbce przez DCL1 Łańcuch miRNA* jest degradowany DCL 3'3' 5'5' miRNA miRNA* 3'3' 5'5' pri-miRNA miRNA MIR gene Cel miRNA

Cele niektórych konserwowanych miRNA Rodzina genowa miRNA Cel (rodzina genów)Funkcja 156Czynniki transkrypcyjne SPL Czas rozwoju 160Czynniki transkrypcyjne ARF Odpowiedź na auksynę, rozwój 165Czynniki transkrypcyjne HD- ZIPIII Rozwój, polarność 172Czynniki transkrypcyjne AP2 Czas rozwoju, tożsamość organów kwiatowych 390TAS3 (tasiRNA), działa na czynniki transkrypcyjne ARF Odpowiedź na auksynę, rozwój 395Transporter siarczanówPobieranie siarczanów 399Ubikwitynacja białekPobieranie fosforanu Adapted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503– –511

miRNA u roślin wykazują odległe podobieństwa do swoich celów Reprinted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511 with permission from Elsevier.503–511 Duplikakcja genu Uważa się, że miRNA u roślin powstały ze swoich sekwencji docelowych w wyniku duplikacji genów, odwróconej duplikacji i dywergencji. Tylko niektóre miRNA zapewniają przewagę selekcyjną i są zachowywane i duplikowane.

tasiRNAs DICER TAS gene RNA Pol II AGO RDR6 tasiRNA są kodowane przez geny TAS transkrybowane przez RNA Pol II Transkrypt jest celem dla miRNA i zostaje rozcięty Rozcięty transkrypt jest kopiowany do dsRNA przez RNA zależną RNA polimerazę (RDR6) (dalszy ciąg na następnym przezroczu) tasiRNAs – trans-acting siRNAS Kodowane przez geny TAS Obróbka pierwotnego transkryptu inicjowana przez miRNA

Biogeneza tasiRNA DICER dsRNA jest rozcinany przez DCL4 na serię krótszych dsRNA, uwalniając z jednego genu TAS wiele cząsteczek tasiRNA. Arabidopsis zawiera cztery rodziny genów TAS Celami dla TAS1 i TAS2 tasiRNA sa geny kodujące białka z powtórzeniami pentapeptydowymi. Celem dla TAS3 tasiRNA są czynniki transkrypcyjne ARF (auxin response factors). Celem dla TAS4 tasiRNA sa czynniki transkrypcyjne MYB.

Z każdego genu TAS powstaje szereg przesuniętych w fazie tasiRNA Reprinted from Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121: , with permission from Elsevier Miejsce wycięcia miRNA w pierwotnym transkrypcie tasiRNA mogą być wytwarzane z dowolnej nici DCL4 porusza się wzdłuż RNA mierząc i rozcianając go.

Mutacje wpływające na tasiRNA wpływają na przejście fazowe Reprinted from Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR3 by TAS3 ta-siRNA affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Curr. Biol. 16: 939–944 with permission from Elsevier.939–944 Mutacja rdr6-15 eliminuje wytwarzanie tasiRNA zip-1 eliminuje wytwarzanie TAS3 tasiRNA Obie mutacje oraz mutacje dcl4 i tas3, przyspieszają zmianę fazową

nat-siRNAs Redrawn from Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas Jr. A., Zhu, J.-K., Staskawicz, B.J., and Jin, H. (2006) A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18002– – Nat-siRNAs – Natural cis-acting siRNAs Wytwarzane z zachodzących na siebie transkryptów. Udział w adaptacji do stresów abiotycznych i biotycznych AGO Zachodzące geny ds. RNA z komplementarnych transkryptów Wyciszeni e

Zastosowania technologii małych RNA Huang, G., Allen, R., Davis, E.L., Baum, T.J., and Hussey, R.S. (2006) Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 14302– –14306 Wyciszanie genów służy do eliminacji alergenów z orzeszków ziemnych. Wyciszanie genów służy do usuwania szkodliwych związków z nasion bawełny, co pozwala na ich zastosowanie jako pokarmu. DNA tworzące siRNA lub miRNA mogą być stabilnie wprowadzane do genomów roślin w celu selektywnego wyciszenia genów. Kontrola zainfekowana przez pasożytniczegio nicienia Oporność indukowana RNAi Rośliny wyrażające dsRNA odpowiadające wybranym genom nicienia sa odporne na infekcje. Wchlonietę przez nicienia dsRNA indukuje wyciszenie jego genów. Kontrola szkodników

Podsumowanie Małe RNA biorą udział w regulacji aktywności i ochronie genomu; specyficzność ich działania wyciszającego opiera się na parowaniu zasad. Celami dla siRNA sa bogate w sekwnecje powtarzalne rejony heterochromatyny, transpozony, wirusy i inne patogeny. Celami dla miRNAs i tasiRNAs sa genby regulatorowe wpływające za czasowy i przestrzenny wzór rozwoju, homeostazę pokarmową i odpowiedzi na czynniki stresowe.