LOGO Identyfikacja genów zależnych od czynnika transkrypcyjnego NFκB, na których ekspresję ma wpływ czynnik transkrypcyjny HSF1 Patryk Janus

Company Logo Problem naukowy Czynniki transkrypcyjne NFκB i HSF1 są kluczowym elementem odpowiedzi na stres komórkowy

Company Logo Model badawczy U2-OS  Ludzkie komórki kostniako – mięsaka (osteosarkomy) a) typu „dzikiego” (wild type): brak aktywacji HSF1 i niskim poziom białek HSP70i w normalnych warunkach hodowli in vitro (37°C, 5% CO2) aktywacja HSF1 i akumulacja białek HSP70 pod wpływem szoku termicznego (hodowla w 43°C przez 1h) ekspozycja na cytokinę TNFa w sposób „standardowy” indukuje aktywację szlaku sygnałowego zależnego od NFkB b) z nadekspresją konstytutywnie aktywnego „transgenicznego” czynnika HSF1 (tgHSF1): sekwencja kodująca HSF1ΔRD (białko HSF1 z delecją domeny regulatorowej ΔRD) wprowadzona do komórek U2OS na drodze stabilnej transfekcji retrowirusowej (w wektorze pLNCX2)

Company Logo Przebieg eksperymentu i analiza wyników Stymulacja komórek cytokiną TNFα (30’) Izolacja RNA 1h po zakończeniu stymulacji cytokiną TNFα Synteza cDNA Ilościowa analiza ekspresji genów regulowanych przez NFkB z użyciem zestawu mikroreakcji RT-PCR (PCR Array) 35 Dodatkowa analiza wybranych genów metodą RT-PCR

Company Logo PCR Array

Company Logo Analiza danych - optymalizacja IL-8  U2-OS WT, kontrolaIL-8  U2-OS WT, 1h po TNFa

Company Logo Analiza danych - optymalizacja przed przeskalowaniem po przeskalowaniu

Company Logo Standaryzacja IL-8  U2-OS WT, kontrola przed przeskalowaniem IL-8  U2-OS WT, kontrola po przeskalowaniu

Company Logo Redukcja szumu

Company Logo Punkty odcięcia Gens crossed with base line [500] 'IL1B' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 'IL6' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 'IL8' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 'FOS' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 'GAPDH' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] GensExp crossed with base line [500] 'IL1B' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 'IL6' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 'IL8' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 'FOS' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 'GAPDH' [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

Company Logo Punkty odcięcia

Company Logo Poziom ekspresji Poziom ekspresji (E) w odniesieniu do kontroli: E = 2 –ΔCt ΔCt = cycleExp - cycleCtr

Company Logo PCR-Array – wyniki: Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w danej linii komórkowej

Company Logo PCR-Array – wyniki: Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w linii U2-OS WT

Company Logo PCR-Array – wyniki: Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w danej linii komórkowej

Company Logo PCR-Array – wyniki: Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w linii U2-OS WT

Company Logo PCR-Array Vs RT-PCR: PCR ARRAY RT-PCR Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w danej linii komórkowej Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w linii U2-OS WT

LOGO Dziękuję za uwagę