Sezonowe porównanie składu chemicznego wybranych gatunków szałwii (Salvia L.) techniką HS/GC-MS M. Sajewicz1, J. Rzepa1, Ł. Wojtal1*, D. Staszek1, M. Hajnos2, T. Kowalska1, M. Waksmundzka-Hajnos3 1Instytut Chemii, Uniwersytet Śląski, Szkolna 9, 40-006 Katowice 2Katedra Farmakognozji, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Chodźki 1, 20-093 Lublin 3Katedra Chemii Nieorganicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Staszica 6, 20-081 Lublin WPROWADZENIE Chemotaksonomia może stanowić podstawę systematyki organizmów opartej na ich składzie chemicznym. Dostarcza dokładniejszych informacji w porównaniu z morfologią i cytologią. Jest to stosunkowo młoda dyscyplina badań, która już przyczyniła się do wprowadzenia istotnych zmian w stosunku do wcześniejszych systemów, odgadujących powiązania filogenetyczne organizmów na podstawie prostego podobieństwa morfologicznego. Tab.1. Sezonowe porównanie składu chemicznego Salvia lavandulifolia L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało się przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng); (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Pogrubioną czcionką zaznaczono marker chemotaksonomiczny (β-mircen) oraz wskaźniki chemotaksonomiczne (β-trans-ocymen i tujon). Związek lotny -Pinen Kamfen -Pinen -Mircen o-Cymen Limonen -Felandren -trans-Ocymen Eukaliptol Cis-Ocymen -Terpinen p-Menta-1.4-dien Tujol Tujenon Tujon Kamfora Borneol Octan bornylu -Chamigren Cadina-3.9-dien Murolen Isokariofilen Kariofilen Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Czas retencji [min] 10.97 11.75 12.20 12.25 13.15 13.26 13.32 13.36 13.50 13.91 13.95 14.59 15.12 15.35 15.47 16.11 16.65 18.84 21.60 22.43 23.31 21.70 22.53 Wysokość profili stężeniowych (%) HS-70 2007 7.22 16.15 2.82 ++ 21.33 1.74 0.09 2.47 13.08 19.03 3.77 1.63 0.15 1.02 2008 5.17 10.70 6.34 12.92 15.04 0.54 2.23 11.99 13.43 4.23 1.42 1.73 3.76 HS-80 8.09 10.27 8.28 14.00 0.21 0.06 9.67 5.67 10.37 7.18 5.46 4.33 5.99 6.74 6.55 12.04 12.12 1.40 9.32 9.01 9.04 0.41 1.70 Deryng 4.13 2.25 1.08 12.70 0.28 9.22 2.88 9.02 7.40 3.26 7.64 7.08 5.10 5.52 14.97 0.61 10.80 11.27 1.77 0.42 8.17 ASE 1.80 0.46 13.44 7.52 49.95 0.85 3.30 0.40 0.47 9.41 19.85 55.94 0.25 3.73 MATERIAŁ ROŚLINNY Próbki szałwii (Salvia lavandulifolia L., Salvia triloba L.) zostały zebrane w Ogrodzie Roślin Leczniczych Katedry Farmakognozji UM w Lublinie w sierpniu 2007r. oraz w październiku 2008r. Materiał roślinny suszono w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze 35 - 40°C przez ok. 40h. Otrzymany materiał przechowywano do czasu analizy w stanie zamrożenia. Następnie odważano 2g (head space i ASE) oraz 50 g (destylacja z parą wodną w aparacie Derynga) suszu liści każdego gatunku rośliny i próbki te roztcierano w moździerzu porcelanowym. CHROMATOGRAFIA GAZOWA Z DETEKCJĄ MASOWĄ (GC-MS) Chromatograf gazowy TRACE 2000 z detektorem mas MS TRACE Finnigan (firmy Thermo Quest) oraz z autosamplerem Combi PAL (firmy CTC), programem do sterowania aparaturą, akwizycji i obróbki danych X-Calibur i biblioteką widm masowych NIST. Kolumna kapilarna: DB-5 30 m • 0,25 mm • 0,25 µm Gaz nośny: Hel o ciśnieniu p=100 kPa Program temperatury: 40°C (3 min); 40 do 150°C (8°/min), izotermicznie 150°C (15 min) Temperatura dozownika: 150°C Energia jonizacji: 70 eV Wygrzewanie próbek: 70 oraz 80°C (15 min) Temperatura interfejsu: 200°C Temperatura źródła jonów: 180°C Rys.1. Sezonowe porównanie chromatogramów próbek Salvia lavandulifolia L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało się przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng); (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Nazwy zidentyfikowanych związków podano w Tab.1. Tab.2. Sezonowe porównanie składu chemicznego Salvia triloba L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng), (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Pogrubioną czcionką zaznaczono wskaźnik chemotaksonomiczny (tujon). Związek lotny -Pinen Kamfen -Pinen -Mircen o-Cymen Limonen -Felandren -trans-Ocymen Eukaliptol Cis-Ocymen -Terpinen p-Menta-1.4-dien Tujol Tujenon Tujon Kamfora Borneol Octan bornylu -Chamigren Cadina-3.9-dien Murolen Isokariofilen Kariofilen Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Czas retencji [min] 10.97 11.75 12.20 12.25 13.15 13.26 13.32 13.36 13.50 13.91 13.95 14.59 15.12 15.35 15.47 16.11 16.65 18.84 21.60 22.43 23.31 21.70 22.53 Wysokość profili stężeniowych (%) HS-70 2007 11.59 0.28 23.40 17.81 17.75 0.38 0.21 2008 2.45 2.04 16.62 36.23 9.47 17.61 2.88 1.78 HS-80 7.41 4.23 14.71 11.05 10.91 11.18 2.52 8.53 6.22 5.72 6.28 17.20 14.28 10.83 12.72 1.65 0.27 7.63 4.82 Deryng 4.22 0.47 11.09 7.96 8.14 4.89 4.38 10.99 8.80 1.21 0.93 11.98 8.22 8.16 4.21 0.69 12.39 9.87 ASE 10.25 24.92 8.78 28.89 5.55 5.77 4.88 38.41 3.33 29.73 8.09 7.35 Salvia lavandulifolia L. Salvia triloba L. TECHNIKI WYODRĘBNIANIA LOTNYCH SUBSTANCJI ORGANICZNYCH Z ROŚLINY Desorpcja z fazy nadpowierzchniowej (head-space) Head space jest prostą i efektywną metodą izolacji lotnych substancji zarówno z materiału stałego, jak i ciekłego. Temperatury desorpcji: 70 i 80°C. Czas wygrzewania: 15 min. Próbka gazowa była dozowana na GC-MS w objętości 0,5 mL przy użyciu autosamplera. Destylacja z parą wodną w aparacie Derynga W kolbie okrągłodennej o pojemności 1000 ml umieszczano 50g materiału roślinnego. Następnie do kolby wlewano 400 ml wody redestylowanej i prowadzono destylację w aparacie Derynga przez 3 h. Destylat dozowano na GC-MS w ilości 1µL. Procedura ta jest opisana w Farmakopei Polskiej VI [2]. Ciśnieniowa Ekstrakcja Cieczowa - Accelerated Solvent Extraction (ASE) Warunki pracy aparatu ASE 200 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) : Przepłukiwanie : 60 s Rozpuszczalnik : eter naftowy Cykle statyczne : 3 Temperatura pieca : 105 oC Ciśnienie : 6.67 MPa Czas wygrzewania : 5 min Czas ekstrakcji statycznej : 10 min Siła płukania : 100%. Każdy ekstrakt był przechowywany w temperaturze -6oC przez 24h w celu pozbycia się substancji balastowych. Następnie były one filtrowane przez filtry strzykawkowe i w ilości 1µL analizowane techniką GC-MS. Rys.2. Sezonowe porównanie chromatogramów próbek Salvia triloba L. Wyodrębnianie lotnych substancji z materiału roślinnego odbywało się przy pomocy: (a) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej z użyciem autosamplera (head-space) w temperaturze 70oC (HS-70); (b) desorpcji z fazy nadpowierzchniowej (head-space) w temperaturze 80oC (HS-80); (c) destylacji z parą wodną w aparacie Derynga o zamkniętym obiegu wody (Deryng); (d) ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (Accelerated Solvent Extraction, ASE). Nazwy zidentyfikowanych związków podano w Tab.2. OBSERWACJE I WNIOSKI Generalnie skład chemiczny badanych gatunków szałwii (Salvia L.) pochodzących z dwóch różnych okresów wegetacyjnych (sierpień 2007r. i październik 2008r.) był bardzo zbliżony (choć nie identyczny), co obrazują chromatogramy przedstawione na Rys.1. i 2. Z pewnością złożyły się na to takie czynniki pogodowe, jak: zróżnicowane nasłonecznienie, różna ilość opadów, różna temperatura itp. Dokonano również analizy chemotaksonomicznej w zależności od okresu zbiorów i stwierdzono: obecność w Salvia lavandulifolia L. -mircenu jako markera chemotaksonomicznego oraz -trans-ocymenu i tujonu – jako czynników chemotaksonomicznych [1], zarówno w jednym, jak i drugim analizowanym okresie wegetacyjnym. obecność w Salvia triloba L. tujonu, będącego czynnikiem taksonomii chemicznej [1], również w próbkach pochodzących z różnych okresów wegetacyjnych. LITERATURA M. Sajewicz, J. Rzepa, M. Hajnos, Ł. Wojtal, D. Staszek, T. Kowalska, M. Waksmundzka-Hajnos. Acta Chromatogr., 21(3), 2009 (w druku) 2. Farmokopea Polska VI, Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne, Warszawa, 2002 *Praca jednego z autorów (Łukasz Wojtal) jest od 2008 roku częściowo wspomagana przez stypendium projektu „Uniwersytet Partnerem Gospodarki Opartej na Wiedzy”, współfinansowane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.