Replikacja, naprawa i rekombinacja DNA u eukariontów

Zasada replikacji DNA

Replikacja DNA jest elementem cyklu komórkowego

U eukariontów DNA występuje w kompleksie zwanym chromatyną

Replikacja u eukariontów Inicjacja, elongacja, terminacja Problem końców chromosomów Jądro - organelle

Inicjacja (replikacja zaczyna się jednocześnie w wielu miejscach)

ORI (Origins of replication) ARS (Autonomously Replicating Sequence) u drożdży Specyficzna sekwencja 200 pz jest minimalną sekwencja wymaganą do inicjacji replikacji chromosomowego DNA. U ssaków inicjacja (ORI) obejmuje sekwencję 10 000 pz U roślin sekwencje ORI nie są zidentyfikowane W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI, ale nie wszystkie funkcjonują w każdej komórce Fragment DNA replikowany z jednego ORI nosi nazwę replikonu ( u roślin długość replikonu to przeciętnie 50-70 kb) Nie wszystkie ORI startują w tym samym momencie, jednak porządek ich uruchamiania jest w komórkach ściśle kontrolowany i zależy od stanu kondensacji chromatyny w danym miejscu.

Kontrola inicjacji Licencjonowanie (kontrola pozytywna) – zapewnia, że chromosomy będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób prawidłowy przejdą przez mitozę i znajdą się w komórce potomnej. Aby nastąpiła inicjacja, do ORI musi się przyłączyć Kompleks Rozpoznający Origin (ORC – Origin Recognition Complex) i dodatkowe białka (czynniki licencjonujące Cdc-6 i Cdt-1) umożliwiające ścisłe pokrycie sąsiadującego DNA białkami MCM (Minichromosome Maintenance). Tylko DNA pokryty białkami MCM może być replikowany. Białka MCM są usuwane przez przesuwające się widełki replikacyjne.

Licencjonowanie w ORI

Negatywna kontrola inicjacji - Geminina Geminina – białko występujące w komórkach w fazie G2 Przeciwdziała przyłączaniu się białek MCM do świeżo zreplikowanego DNA (zablokowanie czynnika Cdt-1) Jest degradowana po zakończeniu mitozy Gemininy nie wykryto w drożdżach i roślinach!

Kontrola inicjacji w cyklu komórkowym

Elongacja Kompleks wielo-enzymatyczny zawierający polimerazę DNA katalizuje przyłączanie deoksyrybonukleotydów do 3’ końca DNA lub RNA przyłączonego do nici matrycowej DNA. Synteza DNA idzie w kierunku 5’ – 3’, a matryca jest odczytywana w kierunku 3’-5’. Polimeraza DNA może dodawać nukleotydy tylko do już istniejącego fragmentu kwasu nukleinowego (primera). Polimeraza DNA jest nieaktywna w nieobecności primera z wolną grupą 3’ OH, związanego poprzez wiązania wodorowe z matrycą. Primery są syntetyzowane przez specyficzną polimerazę rybonukleotydową zwaną ‘DNA primazą’. Inicjuje ona syntezę primera rozpoczynając od rybonukleotydu purynowego.

Przyłączanie deoksyrybonukleotydów przez polimerazę DNA

Elongacja - cd Ze względu na asymetrię widełek replikacyjnych *(kierunki!) synteza DNA jest w połowie nieciągła. Na nici wiodącej (jeden primer) dodawanie nukleotydów odbywa się w sposób ciągły. Na nici opóźnionej synteza odbywa się w formie krótkich fragmentów Okazaki, z których każdy wymaga swojego primera. Wytworzenie ciągłej cząsteczki na matrycy nici opóźnionej wymaga systemu naprawy DNA zawierającego specyficzną rybonukleazę – RNazę H, który usuwa primery RNA i zastępuje je fragmentami DNA. Inny enzym – ligaza DNA łączy koniec 3’ nowego fragmentu DNA z 5’ końcem fragmentu DNA poniżej.

Elongacja - widełki replikacyjne

Elongacja - cd W jądrze eukariontów występują trzy główne polimerazy DNA – α, δ i ε. α – głównie funkcja primazy δ i ε – synteza DNA na nici prowadzącej i opóźnionej. Helikaza DNA (występuje w kompleksie z pol δ i ε ) rozplata dwuniciowy DNA u nasady widełek. Topoizomerazy DNA usuwają napięcia torsyjne powstające w wyniku rozplatania (są przyłączone przed widełkami).

Elongacja - cd

Wierność replikacji Wysoka wierność replikacji (śr. 1 błąd na 10 9 zreplikowanych pz). Polimerazy DNA są enzymami z funkcją autokorety (proofreading), które usuwają własne błędy podczas replikacji. Kluczowe dla autokorekty są ich aktywności 3’-5’ egzonukleazy, dzięki którym usuwają źle sparowane nukleotydy od 3’ końca nowo zsyntetyzowanego fragmentu DNA. Specjalny system naprawy uzupełnia następnie brakujące fragmenty nici.

Niektórych błędów nie da się skorygować

Terminacja replikacji Terminacja następuje w miejscach, w których spotykają się nowo syntetyzowane nici DNA powstałe z dwóch sąsiadujących miejsc ORI.

Aktywność telomerazowa -replikacja końców chromosomów (telomerów)

Punkty kontrolne (checkpoints) w cyklu komórkowym

Chromosomy politeniczne (Drosophila – 10 rund replikacji bez rozdzielania cząsteczek = 2048 cząsteczek ułożonych obok siebie)

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)

Produkty PCR (polimeraza Taq)

Przyczyny uszkodzeń DNA i ich efekty Tlen, wolne rodniki UV Związki alkilujące Spontaniczna deaminacja (C do U) Przerwanie łańcucha Modyfikacje chemiczne zasad włączanie niesparowanych zasad w trakcie replikacji

Uszkodzenia DNA - przykłady

Systemy naprawy DNA System helikazy XPA (Xerdoerma pigmentosum) Wycięcie nukleotydów (dimery pirymidyn, aberracje struktury) Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (mylnie sparowane zasady) Naprawa przez wycięcie zasad (nietypowe – hipoksantyna, uracyl-, zalkilowane zasady) Uwaga: demetylacja 5-met-cytozyny! Naprawa bezpośrednia (metyloguanina, dimery pirymidyn) System helikazy XPA (Xerdoerma pigmentosum) Homologi bakteryjnych białek typu Mut Glikozylaza DNA, polimeraza δ Guanino-6-metylotransferaza

Rekombinacja DNA Gra ważną rolę w podziale mejotycznym komórek (zapewnia zróżnicowanie genetyczne gamet) i, na dłuższą metę - w ewolucji (rearanżacje sekwencji DNA umożliwiają nowe kombinacje sekwencji, które mogą generować nowe rodzaje RNA i białek, wpływając na fenotyp). Mechanizmy rekombinacji są powiązane ściśle z mechanizmami replikacji i naprawy

Rekombinacja w podziałach mejotycznych

Rodzaje rekombinacji Rekombinacja homologiczna występuje pomiędzy długimi sekwencjami, które zawierają rejony w dużym stopniu do siebie podobne (np. rekombionacja mejotyczna). Wymaga białek typu RecA; katalizują one reakcję przeniesienia nici, która umożliwia jednoniciowemu fragmentowi wniknięcie w strukturę dwuniciową w rejonie homologii (powstaje przejściowa struktura trójniciowa). Rekombinacja miejscowo specyficzna (np. rearanżacja genów immunoglobulin) występuje w specyficznych loci, nie wymaga długich rejonów homologii ani białek typu RecA. Wymaga białka rekombinazy (integrazy) i krótkich sekwencji palindroomowych w DNA donorowym i akceptorowym. Rekombinacja nieuprawniona może zachodzić w obecności krótkich rejonów homologicznych (udział polimerazy RNA), a także przy braku jakiejkolwiek homologii (np. integracja do genomów roślin) (udział gyrazy, tj. topoizomerazy II).

Struktura Hollidaya – etap pośredni w rekombinacji homologicznej