Michał Pietrusiński Uniwersytet Medyczny w Łodzi Łódź 2008 Terapia genowa Michał Pietrusiński Uniwersytet Medyczny w Łodzi Łódź 2008

Technologia klasycznej terapii genowej Geny: Mogą zostać wprowadzone do komórek gospodarza drogą bezpośrednią lub pośrednią Mogą zintegrować się z genomem gospodarza lub pozostać poza genomem Główne podejścia wprowadzania genów w terapii genowej do komórek gospodarza: Transfer ex vivo Transfer in vivo

Transfer ex vivo Celem uniknięcia reakcji autoimmunologicznej komórki pobiera się od gospodarza Transfer sklonowanych genów do komórek hodowlanych Selekcja zrekombinowanych komórek na podłożu wzrostowym in vitro Wprowadzanie zrekombinowanych komórek z powrotem do organizmu gospodarza Przykłady: komórki skóry; podobieństwo do transplantacji komórek np. przeszczep szpiku kostnego

Transfer in vivo Transfer sklonowanych genów bezpośrednio do komórek gospodarza Stosowany w przypadku, gdy komórek nie można hodować in vitro np. komórki nerwowe lub komórek nie można z powrotem efektywnie wprowadzać do organizmu gospodarza Konieczność stosowania wektorów: wirusowych nie-wirusowych

Podstawy Efektywny transfer sklonowanych genów do komórek, celem wywołania ekspresji na możliwie wysokim poziomie Wielkość wprowadzanego fragmentu bardzo ograniczona – zasadność stosowania cDNA flankowanego silnymi sekwencjami promotorowymi Po transferze, geny mogą zintegrować się z genomem gospodarza lub pozostać niezintegrowane (episomy)

Geny zintegrowane z chromosomem Zalety: Replikacja obcego genu wraz chromosomem podczas podziału komórki Wszystkie komórki potomne zawierają sklonowany gen Łatwość uzyskania długoterminowej ekspresji sklonowanego genu Przykłady: tkanki złożone z komórek aktywnie dzielących się – komórki macierzyste Wady: Insercja sklonowanych genów zachodzi w dowolnych miejscach (różnych dla poszczególnych komórek) Ekspresja na zmiennym poziomie na skutek umieszczenia genu w silnie skondensowanym regionie heterochromatynowym Śmierć komórki Indukcja procesu karcenogenezy – aktywacja onkogenu, inaktywacja genu supresorowego lub apoptotycznego

Geny niezintegrowane z chromosomem Problem z uzyskaniem wysokiej ekspresji wprowadzonego genu – nie wszytkie komórki potomne odziedziczą klon Konieczność wielokrotnego powtarzania terapii Aplikacja techniki do komórek nie dzielących się

Wektory wirusowe Onkoretrowirusy Adenowirusy Wirusy adeno-associated Wirusy HSV (Herpes simplex-opryszczka) Lentiwirusy

Porównanie wybranych cech wektorów wirusowych cecha Onkoretro-wirusy Adenowirusy Adeno-associated Lentiwirusy Liposomy Wielkość wstawki 7-7.5kb >30kb 4.0kb Bez ograniczeń Integracja do chromosomu Tak Nie Tak/Nie Znikoma Czas ekspresji in vivo Krótki Długi Stabilność Dobra ? B.dobra Droga transferu Ex vivo Ex vivo/in vivo Stężenie (cząstek/ml) > Nieograniczone Łatwość hodowli Łatwa Trudna Odpowiedź immunologiczna Niewielka Silna Wcale Aspekty bezpieczeństwa Mutageneza Odp. Immunol. Toksyczność 108 1011 1012 108

Mechanizm działania wektorów retrowirusowych

Mechanizm działania wektorów adenowirusowych

Adenowirusy

Nie-wirusowe wektory stosowane w terapii genowej Liposomy Bezpośredni transfer/bombardowanie cząsteczkami – np. komórki mięśniowe Endocytoza zależna od receptora

Liposomy

Gene gun

Endocytoza

Terapia genowa a choroby dziedziczne Najłatwiejszy cel: choroby monogenowe dziedziczące się w sposób autosomalny recesywny bo: Najczęstsze mutacje prowadzą do utraty funkcji Chorzy maja zmutowane oba allele – całkowity lub prawie całkowity zanik ekspresji genu Heterozygoty posiadając ekspresje na poziomie 50% to asymptomatyczni nosiciele W wielu przypadkach ekspresja genu na bardzo małym poziomie może przywrócić fenotyp prawidłowy W przypadku chorób autosomalnych dominujących mutacja utraty funkcji w jednym locus chromosomowym (50%) może prowadzić do silnych objawów chorobowych

Konsekwencje spadku poziomu stężenia HGPRT Poziom aktywności HGPRT (w % w stosunku do normalnego) Fenotyp >60 Normalny 8 – 60 Neurologicznie normalny, hiperurikemia 1,6 – 8 Neurologicznie z problemami 1,4 – 1,6 Zespół Lescha – Nyhana, inteligencja w granicach normy <1,4 Klasyczny zespół Lescha – Nyhana, opóźnienie umysłowe

Pierwszy eksperyment – niedobór deaminazy adenozyny (ADA) 14.09.1990 – 4 letnia dziewczynka ADA Degradacja kwasów nukleinowych, Enzym „housekeeping” Brak ADA upośledza limfocyty T i prowadzi do ostrego złożonego niedoboru odporności (SCID) Gen małych rozmiarów, dobrze poznany Limfocyty T łatwe do hodowli in vitro – transfer ex vivo Kontrola regulacji ekspresji na niskim poziomie

Ashanti de Silva

Bubble boy

β-talasemia – zaburzenie syntezy łańcuchów globiny w hemoglobinie Gen β-globiny (HBB ) Gen niewielkich rozmiarów, dobrze poznany Dziedziczenie autosomalne recesywne Skomplikowane mechanizmy kontroli sterujące ekspresją genów Poziom β-globiny musi być równy poziomowi α-globiny Przewaga β-globiny na rzecz α-globiny prowadzi do ujawnienia fenotypu α-talasemii

Rodzinna hipercholesterolemia Defekt receptorów LDL normalnie syntetyzowanych w wątrobie - miażdżyca Dziedziczenie autosomalne dominujące 50% chorych heterozygotycznych mężczyzn umiera przed 60 r. życia Osobniki homozygotyczne umierają we wczesnym dzieciństwie Hepatocyty Łatwe do hodowli in vitro – transfer ex vivo Mogą być wprowadzane bezpośrednio przez system żył łączących jelita z wątrobą Po zastosowaniu terapii stosunek LDL/HDL ulega zmniejszeniu i utrzymuje się przez długi czas Zabieg wiąże się z wycięciem fragmentu wątroby Odporne na infekcje retrowirusami

Mukowiscydoza Dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny Wiąże się z defektem transportu jonów chlorkowych w komórkach nabłonkowych Ekspresja genu CFTR pierwotnie zachodzi w płucach Jedyna możliwość to transfer in vivo – komórki płuc nie dają się hodować in vitro Pierwsze próby z użyciem wektorów adenowirusowych w 1993r Choroby płuc Konieczność ścisłej kontroli ilości dawki adenowirusów Użycie liposomów jako wektorów o wiele bezpieczniejsze, jednak efektywność transferu znacznie mniejsza