Szkoła Letnia, Zakopane 2006 WALIDACJA PODSTAWOWYCH METOD ANALIZY CUKRU BIAŁEGO Zakład Cukrownictwa Politechnika Łódzka Krystyna LISIK

Szkoła Letnia, Zakopane Walidacja jest potwierdzeniem przez zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały spełnione szczegółowe wymagania dotyczące konkretnie zamierzonego zastosowania (wg PN-EN ISO/IEC 17025:2005). Definicje Walidacja obejmuje: ● metody nieznormalizowane, ● opracowane lub rozwijane przez laboratorium, ● metody znormalizowane, stosowane poza zakresem normalizacji, ● w praktyce, wszystkie metody stosowane w danym laboratorium.

Szkoła Letnia, Zakopane Podczas procesu walidacji należy określić następujące cechy charakterystyczne metod analitycznych: 1. dokładność, 2. precyzję, 3. powtarzalność, 4. odtwarzalność, 5. niepewność wyniku pomiaru, 6. granicę wykrywalności, 7. specyficzność i selektywność, 8. liniowość, 9. zakres pomiarowy.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Dokładność – stopień zgodności między wynikiem badania a przyjętą wartością odniesienia. Do opisu dokładności metody pomiarowej stosuje się dwa terminy: „poprawność” i „precyzja” Poprawność – stopień zgodności między wartością średnią otrzymaną na podstawie dużej serii wyników badania a wartością prawdziwą lub przyjętą wartością odniesienia.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Precyzja – stopień zgodności pomiędzy niezależnymi wynikami badania otrzymanymi w ustalonych warunkach. Precyzja nie ma odniesienia do wartości rzeczywistej lub innej określonej wartości. Zależy tylko od rozkładu błędów losowych (przypadkowych). Precyzja jest pojęciem, które opisuje zmienność wyników powtarzanych. Za miarę precyzji przyjmuje się zwykle odchylenie standardowe wyników badania lub jego pochodne. Im większe jest odchylenie standardowe, tym precyzja jest mniejsza. Skrajnymi przypadkami określania precyzji są warunki powtarzalności i warunki odtwarzalności.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Powtarzalność – precyzja przy spełnieniu warunków powtarzalności. Warunki powtarzalności – warunki, w których niezależne wyniki badania takich samych jednostek badania są otrzymane: ● za pomocą tej samej metody, ● w tym samym laboratorium, ● przez tego samego operatora, ● z użyciem tego samego wyposażenia, ● w krótkich odstępach czasu.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Odchylenie standardowe powtarzalności – odchylenie standardowe wyników badania otrzymanych w spełnionych warunkach powtarzalności. Jest to miara rozrzutu rozkładu wyników badania w spełnionych warunkach powtarzalności.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Granica powtarzalności – wartość, której z prawdopodobieństwem 95% nie przekracza wartość bezwzględna różnicy między dwoma wynikami badania otrzymanymi w spełnionych warunkach powtarzalności. Granicę powtarzalności oznacza się zwykle przez r.

Szkoła Letnia, Zakopane W przypadku metod znormalizowanych, w normalnej praktyce laboratoryjnej, wykonuje się co najmniej dwa równoległe oznaczenia i porównuje różnicę bezwzględną między wynikami z pewną wartością krytyczną. Tę wartością krytyczną jest granica powtarzalności określona wzorem: gdzie: s r – odchylenie standardowe powtarzalności wyznaczone na znacznej liczbie pomiarów. Zaleca się, aby wartość bezwzględna różnicy nie przekraczała granicy powtarzalności. Jeżeli wartość ta nie przekracza r, to oba wyniki uznaje się za poprawne, a ich średnią podaje się jako wynik końcowy.

Szkoła Letnia, Zakopane Odtwarzalność – precyzja w warunkach odtwarzalności. Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Warunki odtwarzalności – warunki, w których wyniki badania takich samych jednostek badania są otrzymane: ● za pomocą tej samej metody, ● w różnych laboratoriach, ● przez różnych operatorów, ● z użyciem różnego wyposażenia.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Odchylenie standardowe odtwarzalności – odchylenie standardowe wyników badania otrzymanych w spełnionych warunkach odtwarzalności. Jest to miara rozrzutu wyników badania przy spełnieniu warunków odtwarzalności.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Granica odtwarzalności – wartość, której z prawdopodobieństwem 95% nie przekracza wartość bezwzględna różnicy między dwoma wynikami badania otrzymanymi w spełnionych warunkach odtwarzalności. Granicę odtwarzalności oznacza się zwykle przez R i wyraża wzorem: gdzie: s R – odchylenie standardowe odtwarzalności.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Niepewność wyniku pomiaru – parametr związany z wynikiem pomiaru, charakteryzujący rozrzut wartości, które można w uzasadniony sposób przypisać wielkości mierzonej. Laboratorium powinno ustalić procedurę szacowania niepewności wyniku pomiaru (analiz), otrzymanego daną metodą. Miarą niepewności może być np. odchylenie standardowe (lub jego wielokrotność) albo połowa szerokości przedziału ufności, odpowiadającego określonemu prawdopodobieństwu.

Szkoła Letnia, Zakopane Definicje wg PN-ISO 5725:2002 Warunki powtarzalności pośredniej – warunki, w których niezależne wyniki badania takich samych jednostek badania są otrzymane: ● za pomocą tej samej metody, ● w tym samym laboratorium, ● z użyciem tego samego wyposażenia, ● przez różnych operatorów, ● w dłuższych odstępach czasu.

Szkoła Letnia, Zakopane Badania własne - Cel badań Wyznaczenie w warunkach powtarzalności cech charakterystycznych znormalizowanych, oficjalnych, metod analizy cukru białego stosowanych w Laboratorium Analityki Cukrowniczej Instytutu Chemicznej Technologii Żywności.

Szkoła Letnia, Zakopane Badania własne - Metodyka badań Zwalidowanio 7 podstawowych metod analitycznych stosowanych do oceny jakości cukru białego: ● oznaczenie polaryzacji - metoda ICUMSA GS2/3-1 (1994), ● oznaczenie wilgotności - metoda ICUMSA GS2/3-15 (1994), ● oznaczenie związków redukujących - metoda Knighta i Allena z EDTA ICUMSA GS2/3-5 (2001), metoda Instytutu Berlińskiego PN-A :1998, ● oznaczenie zabarwienia roztworu cukru - metoda ICUMSA GS2/3-10 (2005), ● oznaczenie typu zabarwienia cukru krystalicznego - metoda ICUMSA GS2-13 (1998), ● oznaczenie zawartości popiołu konduktometrycznego - metoda ICUMSA GS2/3-17 (2002).

Szkoła Letnia, Zakopane Badania własne - Metodyka badań Każde oznaczenie wykonano w 10 powtórzeniach w warunkach powtarzalności, tj: ● w tej samej próbie cukru, ● za pomocą tej samej metody, ● w tym samym laboratorium, ● z użyciem tego samego wyposażenia, ● w krótkich odstępach czasu, ● przez tego samego analityka.

Szkoła Letnia, Zakopane Badania własne - Metodyka badań Na podstawie uzyskanych wyników pomiarów wyznaczono cechy charakterystyczne badanych metod: ● wartość średnią, ● rozstęp, ● odchylenie standardowe powtarzalności, ● względne odchylenia standardowe powtarzalności, ● współczynnik zmienności, ● granice powtarzalności.

Szkoła Letnia, Zakopane Badania własne - Metodyka badań Wyznaczone parametry porównano z precyzją określoną w: ● przepisach ICUMSA, ● rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 lutego 2004 r. w sprawie metod analiz niektórych produktów i półproduktów przemysłu cukrowniczego, ● polskich normach PN-A dotyczących metod badań.

Szkoła Letnia, Zakopane Badania własne - Wyniki Uzyskane wyniki są przedstawione w kolejnych tabelach 1 -15

Szkoła Letnia, Zakopane Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia 99,781 ° Z Najmniejsza wartość 99,71 ° Z Największa wartość 99,83 ° Z Rozstęp 0,12 ° Z Odchylenie standardowe powtarzalności 0,0502 ° Z Względne odchylenie standardowe powtarzalności 0,00050 Współczynnik zmienności0,050 % Granica powtarzalności 0,140 ° Z Tabela 1. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania polaryzacji cukru białego

Szkoła Letnia, Zakopane Tabela 2. Porównanie precyzji oznaczania polaryzacji cukru białego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS2/3-1 (1994) Rozp. MR i RW z dnia r. PN-A : 1998 Cukier. Metody badań Badania własne Δ  0,066  Z Wynik podaje się z dokładnością 0,01  Z Δ  0,1  Z Wynik podaje się z dokładnością 0,1  Z Δ  0,066  Z Wynik podaje się z dokładnością 0,1  Z  = 0,140  Z

Szkoła Letnia, Zakopane Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia 0,0103 % (m/m) Najmniejsza wartość0,008 % (m/m) Największa wartość0,013 % (m/m) Rozstęp0,005 % (m/m) Odchylenie standardowe powtarzalności 0,00132 % (m/m) Względne odchylenie standardowe powtarzalności 0,128 Współczynnik zmienności12,8 % Granica powtarzalności0,0037 % (m/m) Tabela 3. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania wilgotności cukru białego

Szkoła Letnia, Zakopane Tabela 4. Porównanie precyzji oznaczania wilgotności cukru białego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS2/1/3-15 (1994) Rozp. MR i RW z dnia PN-A : 1996 Cukier. Metody badań Badania własne Równoległe oznaczenia są poprawne, jeżeli żadne z nich nie różni się więcej niż o ±10 % od średniej arytmetycznej. Nie ma danych o precyzji metody z testów międzylaboratoryjnych. Δ  0,02 % ( m/m )Δ  0,005 % ( m/m ) Wynik podaje się z dokładnością 0,01 % (m/m)  =0,004 % ( m/m )

Szkoła Letnia, Zakopane Wyniki Liczba pomiarów 2020 Wartość średnia 0,0047 % (m/m) Najmniejsza wartość0,004 % (m/m) Największa wartość0,006 % (m/m) Rozstęp0,002 % (m/m) Odchylenie standardowe powtarzalności 0, % (m/m) Względne odchylenie standardowe powtarzalności 0,208 Współczynnik zmienności20,8 % Granica powtarzalności0,0027 % (m/m) Tabela 5. Parametry statystyczne – walidacja metody Knighta i Allena oznaczania inwertu

Szkoła Letnia, Zakopane Tabela 6. Porównanie precyzji oznaczania inwertu metodą Knighta i Allena W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS2/3-1 (2001) Rozp. MR i RW z dnia PN-A : 1998 Cukier. Metody badań Badania własne Δ  0,004 % ( m/m ) W zakresie: 0,009 % ÷ 0,04 % Δ  0,005 % ( m/m )Δ  0,01 % ( m/m ) Wynik podaje się z dokładnością 0,001 % (m/m)  =0,003 % ( m/m )

Szkoła Letnia, Zakopane Wyniki Liczba pomiarów 2020 Wartość średnia 0,0161 % (m/m) Najmniejsza wartość0,014 % (m/m) Największa wartość0,019 % (m/m) Rozstęp0,005 % (m/m) Odchylenie standardowe powtarzalności 0,00173 % (m/m) Względne odchylenie standardowe powtarzalności 0,108 Współczynnik zmienności10,8 % Granica powtarzalności0,0048 % (m/m) Tabela 7. Parametry statystyczne – walidacja metody Instytutu Berlińskiego oznaczania inwertu

Szkoła Letnia, Zakopane Tabela 8. Porównanie precyzji oznaczania inwertu metodą Instytutu Berlińskiego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA Rozp. MR i RW z dnia PN-A : 1998 Cukier. Metody badań Badania własne ICUMSA nie zaleca Metody Instytutu Berlińskiego do oznaczania inweru w cukrze białym Δ  0,02 % ( m/m ) w cukrze przemysłowym Δ  0,01 % ( m/m ) Wynik podaje się z dokładnością 0,01 % (m/m)  =0,005 % ( m/m ) Przy zawartości inwertu 0,016 % (m/m)

Szkoła Letnia, Zakopane Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia 16,56 IU Najmniejsza wartość 16,2 IU Największa wartość17,2 IU Rozstęp1,0 IU Odchylenie standardowe powtarzalności 0,328 IU Względne odchylenie standardowe powtarzalności 0,0198 Współczynnik zmienności2,0 % Granica powtarzalności0,92 IU Tabela 9. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania zabarwienia roztworu cukru białego

Szkoła Letnia, Zakopane Tabela 10. Porównanie precyzji oznaczania zabarwienia roztworu cukru białego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS2/3-10 (2005) Rozp. MR i RW z dnia PN-A :1998/ AZ1:2005 Cukier. Metody badań Badania własne Δ  3 IU W zakresie do 50 IU Nie zawiera procedury oznaczania zabarwienia roztworu cukru białego Δ  3 IU W zakresie do 50 IU  = 0,9 IU Przy zabarwieniu 17 IU

Szkoła Letnia, Zakopane Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia1,778 Najmniejsza wartość1,74 Największa wartość1,82 Rozstęp0,08 Odchylenie standardowe powtarzalności 0,0326 Względne odchylenie standardowe powtarzalności 0,0183 Współczynnik zmienności1,8 % Granica powtarzalności0,091 Tabela 11. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania typu zabarwienia cukru krystalicznego

Szkoła Letnia, Zakopane Tabela 12. Porównanie precyzji oznaczania typu zabarwienia cukru krystalicznego - reflektancji W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS2-13 (1998) Rozp. MR i RW z dnia PN-Cukier Metody badań Badania własne Δ  0,135 Refleksometr Sucroflex firmy Dr Kernchen Nie zawiera procedury oznaczania reflektancji  = 0,091 Refleksometr Succharoflex firmy Schmidt&Heansch

Szkoła Letnia, Zakopane Wyniki Liczba pomiarów 1010 Wartość średnia 0,0121 % (m/m) Najmniejsza wartość0,0117 % (m/m) Największa wartość0,0126 % (m/m) Rozstęp0,0009 % (m/m) Odchylenie standardowe powtarzalności 0, % (m/m) Względne odchylenie standardowe powtarzalności 0,024 Współczynnik zmienności2,4 % Granica powtarzalności0,00081 % (m/m) Tabela 13. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania popiołu konduktometrycznego

Szkoła Letnia, Zakopane Tabela 14. Porównanie precyzji oznaczania popiołu konduktometrycznego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS2/3-17 (2002) Rozp. MR i RW z dnia PN-A : 1998 Cukier. Metody badań Badania własne Δ  0,00115 % ( m/m ) Przy przeciętnej zawartości popiołu 0,0123 % (m/m) Nie zawiera procedury oznaczania popiołu konduktometrycznego Δ  0,005 % ( m/m ) Wynik podaje się z dokładnością 0,01 % (m/m)  =0,00081 % ( m/m ) Przy zawartości popiołu 0,0121 % (m/m)

Szkoła Letnia, Zakopane Tabela 15. Zestawienie precyzji oznaczania podstawowych metod analizy cukru białego OznaczanieICUMSA Rozp. MR i RW z dnia 13 lutego 2004 r. PN - Cukier Metody badań Badania własne Polaryzacja [°Z]   0,066   0,1   0,066   0,140 Wilgotność [%]---   0,02   0,005   0,004 Inwert metodą Knighta i Allena [%]   0,004   0,005   0,01   0,003 Zabarwienie roztworu [IU]     3   0,9 Reflektancja [typ]   0,   0,091 Popiół konduktometryczny [%]   0,   0,005   0,00081 Δ - różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w warunkach powtarzalności

Szkoła Letnia, Zakopane Podsumowanie Na podstawie wyznaczonych cech charakterystycznych metod analitycznych wykazano, że oficjalne metody stosowane do oceny jakości cukru białego w Laboratorium Analityki Cukrowniczej są wykonywane poprawnie i spełniają wymagania zawarte w przepisach ICUMSA, w rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 lutego 2004 r. oraz w polskich normach dotyczących metod badań.

Szkoła Letnia, Zakopane Literatura 1. Dobecki M. (red.): Zapewnienie jakości analiz chemicznych. Instytut Medycyny Pracy im. prof. J. Nefera, Wyd. 3, Łódź 2004, ISBN PN-ISO :2002. Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 1: Ogólne zasady i definicje. 3. PN-ISO :2002. Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 2: Podstawowa metoda określania powtarzalności i odtwarzalności standardowej metody pomiarowej. 4. PN-ISO :2002. Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 3: Pośrednie miary precyzji standardowej metody pomiarowej. 5. PN-ISO :2002. Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 4: Podstawowe metody wyznaczania poprawności standardowej metody pomiarowej. 6. PN-ISO :2002 Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 5: Alternatywne metody wyznaczania precyzji standardowej metody pomiarowej. 7. PN-ISO :2002 Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 6: Stosowanie w praktyce wartości określających dokładność. 8. PN-ISO/IEC 17025:2005. Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących.