Testy zgodności przed przetoczeniem Przetaczanie krwi

Prezentacja na temat: "Testy zgodności przed przetoczeniem Przetaczanie krwi"— Zapis prezentacji:

1 Testy zgodności przed przetoczeniem Przetaczanie krwi
Immunohematologia Antygeny grup krwi Badanie przeciwciał Testy zgodności przed przetoczeniem Przetaczanie krwi

2 Historia odkryć antygenów grupowych krwi
Antygeny Odkrycie  Układ rok  Autorzy A B O 1900 Landsteiner MNS 1927 Landsteiner and Levin P Landsteiner and Levin Rh -Hr 1937 Landsteiner and Wiener Kell 1946 Coombs, Mourant and Race Lewis Mourant Lutheran Callender and Race Duffy 1950 Cutbush, Mollison and Parker Kidd 1951 Allen, Diamond and Niedziela Diego 1954 Levine, Koch, McGee and Hill Js 1957 Giblett

3 Antygeny krwinek czerwonych
Antygeny krwinek czerwonych charakteryzują następujące cechy: Ich obecność stwierdza się na podstawie reakcji ze swoistym przeciwciałem. Wynikiem tej reakcji jest: aglutynacja (ag +ab) lub liza (ag+ab+C’) Są one dziedziczone zgodnie z prawami Mendla Ich ekspresja pojawia się w życiu płodowym, w pełni wykształca się po urodzeniu i wczesnym okresie noworodkowym, pozostaje do końca życia Układ antygenów ABO jest jedynym, przeciwko któremu w surowicy i osoczu znajdują się regularne, naturalne przeciwciała przeciwko antygenom nieobecnym na własnych krwinkach

4 Podstawy genetyki Geny strukturalne - zawiadują syntezą białek
Geny regulatory (hamujące, modyfikujące) - kontrolują ilość antygenu produkowanego przez geny strukturalne Geny amorficzne – gen niemy (produkty nieznany) Genotyp – to zespół genów odpowiedzialnych za syntezę cech Fenotyp – to cechy, które można wykryć badaniami laboratoryjnymi

5 Podstawy genetyki Geny zajmujące jedno locus w chromosomie
geny alternatywne geny alleliczne allele Układ, w którym są dwa lub więcej alleli to układ polimorficzny Niezależnie od liczby allelicznych genów tylko jeden z nich może zająć odpowiednie locus w danym chromosomie Chromosomy dziedziczy się po jednym z każdej pary ( 22 pary u człowieka) Homozygota = dwa odpowiednie loci zajęte jest przez dwa identyczne allele (geny) Heterozygota = dwa odpowiednie loci zajęte przez różne allele Homozygota syntetyzuje antygen w podwójnej dawce Heterozygota syntetyzuje antygen w pojedynczej dawce Charakter genu może być : dominujący ustępujący (recesywny) kodominujący (ekspresja genu ujawnia się zawsze)

6 Podstawy genetyki grup krwi -
Zasady genetyki grup krwi : 1.Antygeny wielocukrowe są budowane przy pomocy transferaz 2.Każdy swoisty cukier jest dodawany do określonego substratu 3. Włączenie nowego cukru odbywa się przy pomocy transferazy będącej pod nadzorem odpowiedniego genu 4. Powstanie antygenu przy pomocy transferazy musi być poprzedzone prawidłowym wykształceniem substratu 5. Niektóre transferazy mogą używać wiecej niż jednego substratu 6. Dodanie nowego cukru do substratu powoduje powstanie nowego antygenu, który maskuje poprzednio zbudowany antygen.

7 Podstawy genetyki grup krwi -
Układ ABO - układ polimorficzny Znane są 3 geny : A, B, i 0, niektórzy uważają że są 4 geny (A1,A2,B i 0) Transferaza A1 różni się od transferazy A2 niższą efektywnością. Lokalizacja – długie ramię chromosomu 9 Regulują syntezą transferazy glikozylowej, która dołącza specyficzny cukier do łańcucha oligosacharydowego Różnice w genach A i B są punktowe,( różnice dotyczą pojedynczej reszty cukrowej) są wynikiem różnicy w swoistości syntetyzowanej transferazy Punktowa różnica w genie 0 powoduje syntezę białka bez aktywności enzymatycznej

8 Antygeny węglowodanowe grup krwi
Prekursorowy łancuch H grupa krwi 0 L-fukoza N acetylo- galaktozamina Antygen A Grupa krwi A1 lub A2 Antygen B Grupa krwi B D-galaktoza Antygen A i B Grupa krwi AB

9 Struktura polisacharydowego łancucha H typu I i typu II

10 Podstawy genetyki grup krwi
Krwinki czerwone grupy 0 i A2 mają duże ilości antygenu H. Gen H i jego allel h dziedziczą się niezależnie od genów ABO (nie są sprzężone) Gen H jest dominujący - gen h amorficzny. Brak genu H (genotyp h/h) zdarza się wyjątkowo rzadko i powoduje. brak łańcucha H (brak transferazy H ). Erytrocyty nosicieli tej cechy nie wykazują obecności antygenu układu AB jednak w ich krwi są obecne odpowiednie transferazy dla antygenu A i B Osoby takie posiadają grupę krwi Bombay (pseudo 0) Oznacza się ją odpowiednio : 0hA, 0hB, 0hAB ( Oh – Bombay lub ABHnull) Osoby te są bardzo trudnymi pacjentami w sytuacji konieczności przetoczenia krwi. Dawca musi być poszukiwany w grupie nosicieli takiego samego defektu. Dawca musi mieć taką samą rzadką grupę krwi.

11 Antygeny krwinek czerwonych w płynach ciała
80% ludzi rasy białej jest nosicielem genów, które determinują obecność antygenów krwinek czerwonych w płynach ciała (wydzielacze) swoistość tych antygenów to H, A, B and Le . Geny regulujące wydzielanie mają dwa allele Se and se Wydzielaczami są osoby z genotypem : SeSe lub Sese Gen Se zawiaduje syntezą fukozylotransferazy dołączajacej fukozę do łańcucha prekursorowego typu I. Powstaje łancuch H typu I Genotyp sese charakteryzuje osoby nie wydzielające Jeśli Erytrocyty są A w płynach są antygeny H i A Erytrocyty są B w płynach są antygeny H i B Erytrocyty są A+B+ - w płynach są antygeny H, A i B Pozwala to na oznaczenie grupy krwi bez pobierania krwi (np. w ślinie) Informacja ta jest ważna dla laboratoriów kryminalistycznych i jest wykorzystywana w identyfikacji podgrup i ustalaniu podłoża osób o nietypowej grupie krwi.

12 Częstość fenotypu AB0 w wybranych populacjach
Niemiecka 32,5 9,4 11 3,1 1,1 42,8 Polska 31,5 9,0 19 6,4 1,6 Euro-Amerykanie 35 10 8 3 1 43 Pł. Am. Indianie 100 Aborygeni 55,6 44,4 Lapończycy 36,1 18,5 4,8 6,2 18,2

13 Różna gęstość antygenu A na krwinkach grupy A1 i A2

14 Antygeny węglowodanowe grup krwi
Inne układy grupowe częstość w populacji 1.Układ Lewis : antygeny Lea and Leb - Lea 22%, Leb72%, Lea-6% Przeciwciała anty Lewis są naturalne klasy IgM Dwie pary genów uczestniczą w budowie antygenów Lewis Le i le oraz Se i se. Geny le i se są amorficzne. Substratem dla tych antygenów jest łańcuch H typu I. Antygeny te są adsorbowane przez błonę krwinki z osocza Le/Le lub Le/le le/le Niewydzielacze se/se Le (a+ b-) (a-b-) Wydzielacze Se/Se lub Se/se Le (a- b+) Le (a- b-)

15 Antygeny węglowodanowe grup krwi
Inne układy grupowe 2. Układ Ii lub IH ( słabe antygeny) Krwinki płodu i pępowiny reagują słabo z przeciwciałem anty-I i silnie z anty-i. Antygeny tego układu pojawiają się dopiero w 2 roku życia Anty-I (IH) przeciwciała są klasy IgM zimnymi aglutyninami. Pacjenci chorujący na mononukleozę lub zapalenia płuc wywołane mycoplasmą mają wysokie miano zimnych aglutynin ze swoistością anty I lub anty i, które są odpowiedzialne za rozwój autoimmunologicznej anemii hemolitycznej 3. P system: częstość - P1 - 79%, P2 amorficzny – 21% (brakP1), P1- determinuje D-galaktoza w łańcuchu H typu II (bez fukozy) Przeciwciała anty P1 są przeciwciałami naturalnymi (IgM)

16 Antygeny białkowe grup krwi
Układ antygenów częstość w populacji 1. Kidd (Jk aand Jkb) Ab. odpornościowe Jka 25%, Jkab 50%, Jkb 25% 2. Duffy ( Fya Fyb) Ab. odpornościowe Fya 17%, Fyab 49%, Fyb 34% Ag Duffy jest receptorem dla Zach. Afryka -70% Duffy minus zarodźca malarii (Plasmodium vivax) Rasa Kaukaska –większość Duffy positive 3. Kell (Kk) ab odpornościowe K 10%, k 90% (K+, k = K- ) 4. MNS Przeciwciała naturalne IgM M 35%,MN,48%, Anty s zawsze odpornościowe N16%, S10%, Ss44%, s45% 5. Rh

17 Układ Kell 10% osób rasy kaukaskiej jest K+
Układ Kell. Geny kodujace antygen k i K sa kodominujace. Przeciwciala anty Kell ( anty k i anty K ) maja podobne dzialanie jak anty Rh D z ukladu Rh. Mogą być przyczyną konfliktu pomiedzy matka i płodem i są przyczyną odczynow poprzetoczeniwych. 10% osób rasy kaukaskiej jest K+ 2% afroamerykanów jest K+ Zgodnie z obowiazującymi przepisami dziewczynkom i kobietom do okresu menopauzy wolno przetaczać krew zgodną w ukladzie KELL ( K- dla K-)

18 Sprzężenie genów kodujących syntezę antygenów MNS

19 Układ Rh Amerykańska Wiener’a Angielska Fisher’a-Race,a Rh-hr CDE-cde
Układ antygenów Rh jest złożony Istnieje różna terminologia Amerykańska Wiener’a Angielska Fisher’a-Race,a Rh-hr CDE-cde Chromosom Ag czynnik Ab Chromosome Ag Ab krwi pojedynczy Rh1 Rho anti-Rho silnie D D anti- D gen R rh’ anti-rh’ sprzężone C C anti- C rh’’ anti-rh” geny E E anti-E

20 Układ Rh Wiener Fisher-Race Gen Ag cz. krwi Gen Ag
r rh hr’ i rh” cde c, d, e r’ rh’ rh’ i hr” Rh Cde C, d, e r” rh” rh”i hr’ (minus) cdE c, d, E ry rh rh’ i rh’’ CdE C, d, E R Rho Rho, hr’ i hr” cDe c, D, e R Rh1 Rho, rh’ i hr’’ Rh CDe C, D, e R Rh2 Rho, rh” i hr’ (plus) cDE e, D, C Rz Rhz Rho, rh” i rh” CDE C, D, E Ważne Rho = D = Rh+ (plus) = 80% populacji

21 Dziedziczenie antygenu RhD (Rh+) zależnosci od genotypu ojca
matka ma genotyp d/d (Rh-)

22 Przykład różnic w budowie antygenu RhD wyjaśnia dlaczego osoba RhD+ może mieć przeciwciała anty D

23 Przykład tłumienia ekspresji antygenu RD przez gen C kodujący antygen RhC

24 Oznaczanie antygenów układu ABO - sprawdzanie odczynników
Surowica kontrolna Krwinki anty A anty B kontrolne A B

25 Oznaczanie antygenów ABO - próba właściwa z krwinkami i surowicą pacjenta
Pacjent Surowica kontrolna Kontrolne krwinki nr anty A anty B A B Dolichotest Wynik Krwinki pacjenta Surowica pacjenta 123 345 A1\A2 234 B 367 AB

26 Badanie Rh ( antygen białkowy) – 1. kontrola odczynników
Kontrola pozytywna surowica RBCs anty-D O Rh + Kontrola negatywna surowica RBCs anty-D O Rh - Odczyt po 1 min (RUM) lub po 15 min (BLEND) inkubacji w temp. Pokojowej i po odwirowaniu 1 min 1800 obr/min Wynik: Aglutynacja RBCs Brak aglutynacji RBCs

27 Ocena Rh próba własciwa kontrola pacjenta
może być pozytywna (+) lub negatywna (-) powinna być negatywna (-) krwinki pacjenta surowica pacjenta krwinki pacjenta surowica anty-D 1 min inkubacja (RUM) lub 15 min (BLEND) temp. pokojowa wirowanie 1 min obr./min. odczyt erytrocyty nie powinny aglutynować jeśli jest aglutynacja - diagnozować chorobę autoimmunologiczną wynik: aglutynacja znaczy erytocyty Rh+ brak aglutynacji znaczy Rh -

28 Oznaczanie przeciwciał definicje
Przeciwciała kompletne - zawsze klasy IgM najczęściej są to ab naturalne zimne ab - reagują z antygenem w temp. pokojowej regularne ab -anty-A lub anty-B nieregularne ab- IgM ab anty inne antygeny np.: H, Le, K Silnie aglutynują krwinki czerwone ponieważ mają budowę pentameru, wielkość cząsteczki pozwala na łączenie kilku krwinek Przeciwciała niekompletne - klasy IgG nie aglutynują krwinek bezpośrednio tylko opłaszczają błonę krwinek ab odpornościowe – powstają w wyniku kontaktu z ag ciepłe ab – optymalna reakcja z antygenem w środowisku z białkiem i temp. 370C

29 Aglutynacja krwinek z ab klasy IgM
= + Ab kompletne anty -x krwinki z ag x Reakcja Ag - Ab =aglutynacja (IgM)

30 Wpływ buforu o niskiej sile jonowej (LISS low ionic strength solution) na aglutnację krwinek ab anty IgG

31 Schemat bezposredniego i pośredniego testu Coombsa Reakcja pomiedzy ab IgM anty X z ag X na krwinkach i ab IgG anty X i ag X na krwinkach Ab klasy IgM anty X anty IgG Ab klasy IgG antyX

32 Bezpośredni test antylobulinowy (BTA) Bezpośredni test Coombsa Krwinki oplaszczone swoistymi przeciwciałami klasy IgG (czarne Y) aglutynują przeciwciała anty IgG ( białe Y – surowica Coombsa)

33 Pośredni test antyglobulinowy (PTA) 1
Pośredni test antyglobulinowy (PTA) 1.inkubacja krwinek z badaną surowicą 2. odpłukanie 3. dodanie do krwinek ab antyIgG

34 Badanie obecności przeciwciał testami antyglobulinowymi
1. Cząsteczki IgG są małe, niezdolne do spowodowania aglutynacji , ale po rozpoznaniu swoistego antygenu wiążą się trwale z błoną krwinek 2. Do wywołania aglutynacji krwinek opłaszczonych abs IgG muszą być dodane abs rozpoznające anty ludzkie IgG ( surowica Coombsa) Bezpośredni test antyglobulinowy (BTA) – jednostopniowa procedura 1. ab anty ludzkie IgG jest dodane do badanych krwinek Wynik: aglutynacja oznacza - krwinki były opłaszczone przez abs brak aglutynacji oznacza – krwinki nie były opłaszczone abs Pośredni test antyglobulinowy (PTA) – dwustopniowa procedura 1. krwinki są dodawane do badanej serowicy - inkubacja, płukanie 2. Ab anty- ludzkie IgG jest dodawane do krwinek Wynik: aglutynacja znaczy - w badanej surowicy były abs przewiwko antygenowi na krwinkach brak aglutynacji znaczy – w surowicy badanej nie było abs.

35 Poszukiwanie przeciwciał w surowicy
Testy antyglobulinowe są stosowane : 1. do oceny zgodności krwi biorcy i dawcy przed transfuzją 2. do rozpoznania anemii hemolitycznej noworodków 3. do oceny niekompletnych auto-przeciwciał w anemii autoimmunologicznej 4. do badań przesiewowych np.: surowic ciężarnych i dawców krwi 5. do identyfikacji swoistości przeciwciał znalezionych w badaniach przesiewowych 6. do określenia antygenów innych układów grup krwi np.: Duffy, Kell i innych

36 Aktywowane komponenty dopełniacza C3 przyłączone do receptora C3 na krwinkach aglutynują je w obecności ab anty IgG

37 Próba zgodności Proba zgodności obejmuje: próbę własciwą
kontrolę własną biorcy kontrolę dodatanią kontrolę ujemną Do testu stosuje się metodą LEN tzn.: krwinki zawieszone są w LISS i traktowane enzymem papainą.

38 Próba zgodności Etap 1: do 4 probowek dodać 1 kroplę buforu LISS zmiesznego z papainą w stosunku 2:1 do probowki nr dodać 2 krople krwinek dawcy do probowki nr „ „ „ „ biorcy do probowek nr 3 i „ „ „ „ wzorcowych Rh+ INKUBACJA 10 min w 37 st. C Etap 2 : do probowek nr 1 i 2 dodać po 2 krople surowicy biorcy do probówki nr 3 dodać 2 krople surowicy anty D do probowki nr 4 dodać surowicę anty AB INKUBACJA 3-5 min w 37 st.C WIROWANIE w 1000 obr/min ODCZYT PO lekkim wstrząśnieniu

39 Próba zgodności – schemat (zawsze z krwią zgodną w ukladzie ABO)
Nr LISS + Enzym =LEN Krwinki Surowica Aglutynacja 1 1 kropla Dawcy Biorcy Jeśli brak to zgodna 2 brak 3 Wzorcowe Rh+ (plus) Anty D +++ Silna 4 Rh + ( plus) Grupy AB Brak Taki wynik upoważnia do przetoczenia, jeśli jest aglutynacja w probowce 1 trzeba zidentyfikować swoistość przeciwciał. Jeśli jest aglutynacja w probowce 2 lub 4 test nieudany technicznie.

40 Poszukiwanie przeciwciał w surowicy z zastosowaniem krwinek wzorcowych
Krwinki wzorcowe są zawsze grupy O: zestaw 14, data ważności 1. dccee Kk Fy(a+b+) Jk(a+b-) MNSsP1 Le(a-b+} 2. Dccee kkFy(a+b-) Jk(a-b+) ssP1 Le(a-b+) 3. DccEe Kk Fy(a+b+) Jk)a+b+) MMSsP1 Le(a-b+) zestaw 15, data ważności 1. Dccee Kk Fy(a+b-) Jk(a+b-) NN ss P2 Le(a-b-) 2. DCcEe KK Fy(a+b+) Jk((a+b-) MMSsP1Le(a+b-)

41 Próba zgodności – Ważne !!!
WYNIK PRÓBY ZGODNOŚCI WAŻNY 48 GODZIN Krew po wykonanej próbie musi być przechowywana w laboratorium przez 5 dni

42 Postępowanie w przypadku podejrzenia o ostry odczyn poprzetoczeniowy
1. Natychmiast przerwać transfuzję i zawiadomić lekarza odpowiedzialnego za zabieg 2. Utrzymać wkłucie dożylne , przetaczać 0,9% roztwór NaCl do wdrożenia właściwego leczenia 3. W celu wykluczenia błędu w dokumentacji sprawdzić: - dane na pojemniku z krwia - wynik próby zgodności - dane identyfikujące pacjenta 4. Niezwłocznie zawiadomić Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa o wystąpieniu poprzetoczeniowego odczynu hemolitycznego 5. Przesłać tam : świeżo pobrane z innej żyły 15 ml krwi z antykoagulantem - pojemnik z pozostałą krwia toczoną - próbki krwi chorego z których wykonano badania zgodności - świeżo pobraną próbkę moczu