Gruźlica Wybrane Dane Epidemiologiczne Diagnosyka Laboratoryjna

Prezentacja na temat: "Gruźlica Wybrane Dane Epidemiologiczne Diagnosyka Laboratoryjna"— Zapis prezentacji:

1 Gruźlica Wybrane Dane Epidemiologiczne Diagnosyka Laboratoryjna
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie 2005/2006

2 Zgony z powodu głównych chorób infekcyjnych
(dane globalne) zgony (mln) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 inf.oddech. AIDS biegunki TB malaria odra wiek < 5 lat wiek > 5 lat (wg. WHO Report on Infectious Diseases 1999)

3 Gruźlica na świecie Na świecie prątkiem gruźlicy zakażonych jest 1,9 mld osób (1/3 światowej populacji) Rocznie na gruźlicę zapada mln osób, w tym 1,5 mln dzieci Rocznie na gruźlicę umiera 2 mln osób, w tym 100 tys. Dzieci 95% nowych zachorowań oraz 80% zgonów z powodu gruźlicy dotyczy krajów ubogich W krajach rozwijających się 80% chorych na gruźlicę to osoby w wieku produkcyjnym Szacuje się, że nieleczony chory zakaża osób w ciągu roku Problemem globalnym jest gruźlica wielolekooporna (Raporty WHO)

4 80 % zachorowań na gruźlicę dotyczy 22 krajów świata

5 TB notification rate, 2003 TB notification rates, 2003 0-24 25-49
50-99 100 or more No report The designations employed and the presentation of material on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. White lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. © WHO 2004

6 Estimated TB incidence rate, 2003
Rates per , all forms of TB 0 - 24 300 or more No estimate The designations employed and the presentation of material on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. White lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement. © WHO 2004

7 Wsp. zachorowań na gruźlicę - dane przybliżone - 2000 r.
600 500 400 300 200 100 Chiny Indie Peru Polska Rosja Nigeria Kongo Kamb. Brazylia Etiopia Filipiny Uganda Tajlandia Indonezja Afganistan Pol.Afryka Zimbabwe

8 Polska - zapadalność na gruźlicę - 2005 r.
Nowo zarejestrowanych chorych (wsp. 24,9) (wszystkie postacie gruźlicy, w tym 260 więźniów,17 cudzoziedmców) kobiety (wsp. 16,2) mężczyźni (wsp. 32,9) miasta wieś Nowe zachorowania (wsp. 21,5) Wznowy (wsp. 2,8)

9 Polska – umieralność z powodu gruźlicy 2004 r.
Gruźlica jako przyczyna zgonu osób Gruźlica układu oddechowego osób Zgony z powodu gruźlicy stanowiły 0,2 % ogółu zgonów Zgony z powodu gruźlicy stanowiły 37,8% zgonów z powodu wszystkich chorób zakaźnych i pasożytniczych

10 Polska –2005 r. 91,2 % wszystkich zachorowań stanowiła gruźlica płuc
8 459 przypadków (w tym AFB+) Lokalizacja pozapłucna przypadków (8,8 % nowo zarejestrowanych) 52 przypadki gruźlicy pozapłucnej z jednoczesną gruźlicą płuc inne lokalizacje to gruźlica: opłucnej przypadków narządów moczowo-płciowych 111przypadków obwodowych węzłów chłonnych 143 przypadków kości i stawów przypadków gruźlicze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych przypadków (w tym 2 dzieci z woj. mazowieckiego)

11 Struktura zachorowań na gruźlicę płuc w Polsce (2005 r.)
naciekowa 87,2% serowate zapal. 1,9% pozaplucna 8,8 % włóknisto-jamista 1,5%

12 Polska-zachorowania na wszystkie postacie gruźlicy
r lat wsp. 1,6 >65 lat wsp. 50,3 0-14 wsp. / mieszk. 15-19 20-44 45-64 65+ 100 80 65 + 60 40 20 0 - 14 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001

13 Gruźlica – zachorowania / 100 000 mieszkańców
wsp. 80 60 Polska Wegry 40 Slowacja 20 Rep.Czeska Niemcy 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 ( wg: WHO Raport Global Tuberculosis Control)

14 Gruźlica – zachorowania / 100 000 mieszkańców
wsp. 140 120 100 Rumunia 80 Lotwa 60 Rosja 40 Bialorus 20 Ukraina 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 ( wg: WHO Raport Global Tuberculosis Control)

15

16 Strategia DOTS: Instytucjonalny nadzór rządowy zwalczania gruźlicy
2. Zgłaszanie przypadków bk(+) rej.służbom epidemiol. 3. Nieprzerwane 6-8 miesięczne leczenie 4. Standardowy system rejestracji i sprawozdawczości

17 (Polska 1996-1997, pozostałe kraje 1994-1997)
Lekooporność wśród chorych na gruźlicę w Polsce w porównaniu z innymi krajami świata pierwotna nabyta Rep.Czeska Polska Francja USA Portugalia Rosja Estonia Litwa 20 40 60 80 100 120 120 100 80 60 na 1 lek i więcej 40 20 USA Rosja Litwa MDR Polska Francja Estonia Rep.Czeska Portugalia   Na podstawie: N Eng J Med. 1998,338,1641 Pneumonol Alergol Pol 1999,11-12,536 (Polska , pozostałe kraje )

18 Wzrost oporności na leki wśród szczepów Mycobacterium tuberculosis
Polska Oporność ogółem (nowe zach.) 3,6 % 6,12% p<0,001 Oporność wielolekowa pierwotna ,6% 1,15% p<0,001 Oporność na 4 leki ,0% ,5%*/ p<0,001 (INH+RMP+SM+EMB) Oporność wielolekowa wtórna ,0 % 8,55% n.s. */ 15 chorych (wg. Augustynowicz i wsp. Zakażenia 1,2003) Badanie na ok szczepów gruźlicy wtórnej i ok pierwotnej

19 Laboratoryjna Diagnostyka Gruźlicy

20 Około 80% zachorowań na gruźlicę wykrywa się z objawów
Jedynym, niepodważalnym potwierdzeniem wstępnego rozpoznania choroby jest uzyskanie dodatnich wyników diagnostyki mikrobiologicznej w 2005 r. wśród nowo zarejestrowanych chorych (9 280) jedynie u potwierdzono gruźlicę bakteriologicznie (58,3 %), wśród chorych na gruźlicę płuc 6

21 Specyfika laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy wiąże się z:
* niskim tempem namnażania się prątków na pożywkach * koniecznością stosowania wielu technik wykrywania zakażenia (mikroskopia, techniki hodowlane,techniki biologii molekularnej) Ujemne wyniki badań laboratoryjnych nie wykluczają rozwoju choroby bowiem żadna z metod laboratoryjnych nie charakteryzuje się 100% czułością

22 Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka. gruźlicy obejmuje
Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka gruźlicy obejmuje (i) bakterioskopię oraz metody molekularne (ii) wyhodowanie prątków pożywka L-J pożywki płynne z różnymi systemami detekcji wzrostu prątków (iii) określenie gatunku wyhodowanych prątków konwencjonalne metody biochemiczno- mikrobiologiczne metody molekularne (PCR, sondy genetyczne) analiza kwasów mikolowych techniką HPLC (iv) określenie lekowrażliwości

23 Miarą nowoczesności laboratorium. diagnostyki gruźlicy jest spełnienie
Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki gruźlicy jest spełnienie powyższych wymogów diagnostycznych w maksymalnie krótkim czasie Docelowo powinno dążyć się do skrócenia czasu diagnostyki do < 25 dni

24 Laboratoria prątka gruźlicy
I Rzędu: mikroskopia II Rzędu: hodowla identyfikacja M.tuberculosis complex ocena lekowrażliwości na INH,RMP,SM,EMB III Rzędu: identyfikacja ważniejszych gatunków testy lekowrażliwości dla leków drugiej linii testy lekowrażliwości dla prątków atypowych

25 B a k t e r i o s k o p i a (+) (-)
(+) (-) Wykrywa chorych silnie prątkujących Czas wykonania około 3 godzin Niska cena badania Nie różnicuje prątków żywych i martwych Nie różnicuje gatunku prątków Czułość w wykrywaniu gruźlicy w plwocinie około 30 %

26

27 Mycobacterium sp. barwienie metodą Ziehl-Neelsena mikroskopia w świetle widzialnym barwienie auraminą mikroskopia w świetle UV

28 potwierdenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MTB
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie ( ) mykobakteriozy n = 9 (7%) TB n = 82 (38%) NTM n = 135 (62%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 126 (93%) potwierdenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MTB

29 obecność prątków wynik
O 1-2 / 300 pól widzenia 1-9 / 100 pól widzenia 1-9 / 10 pól widzenia 1-9 / 1 pole widzenia > 9 / 1 pole widzenia Prawdopodobnie negatywny (nie wystarczająca liczba prątków dla wykrycia w bekterioskopii) Nie uznawany za pozytywny, konieczność badania dalszych próbek (sporadyczne) (nieliczne) (średnio liczna) (liczne) obecność prątków wynik */ przy powiększeniu 800 x x (

30 (+) (-) (+) (-) H o d o w l e Czas hodowli do 8-10 tygodni
Czułość - około 70 % Potwierdzenie obecności żywych prątków Pozyskanie szczepu do typowania gatunku Możliwość określenia lekoporności H o d o w l e Pożywka Loewensteina-Jensena Pożywki płynne (+) (-) (+) (-) Czas hodowli do 8-10 tygodni Niska cena badania Hodowla kilku -dniowa Wymogi sprzętowe

31 Systemy detekcji wzrostu prątków na pożywkach płynnych
*radiometryczny Bactec 460 Tb (Becton Dickinson) (możliwość różnicowania M.Tbc /MOTT) *kolorymetryczny system - MB Bac T (Organon Teknika Corporation), (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze, osobne podłoża dla próbek krwawych) *system fluorymetryczny MGIT (Mycobacterial Growth Indicatory Tube) (Beckton Dickinson) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze)

32 Identyfikacja gatunku prątków
W większości laboratoriów wykonuje się jedynie test niacynowy

33 kwas mykolowy galaktan arabinian łącznik peptydoglikan

34 HPLC (high pressure liquid chromatography)
HPLC (high pressure liquid chromatography) Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa Analiza składu kwasów mykolowych: Hydroliza Ekstrakcja chloroformem Przekształcenie kwasów mykolowych w bromofenacylowe pochodne Rozdział na kolumnie w fazie odwróconej Wzór elucyjny badanej próby Analiza porównawcza z biblioteką zgromadzonych wzorów elucyjnych szczepów wzoprcowych z ATCC M.tuberculosis LMW HMW M.avium LMW HMW M.interjectum LMW HMW

35 Metody biologii molekularnej
(+) (-) Czas wykonania badania – kilka / kilkanaście godzin Czułość wykrywania gruźlicy około % Swoistość % Wykrywanie zakażeń w bardzo wczesnej fazie Stosunkowo wysoka cena badania Szkolenie, aparatura Możliwość identyfikacji jedynie 5 gatunków prątków: M.tbc complex, M.avium, M.intracellulare, M.konsasii, M.gordonae Jedynie metodą molekularną można w czasie kilku godzin wykryć obecność prątków gruźlicy bezpośrednio w materiale klinicznym

36 zanieczyszczenia środowiskowe lub kolonizacja
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie ( ) mykobakteriozy n = 22 (11%) TB n = 113 (36%) NTM n = (64%) NTM zanieczyszczenia środowiskowe lub kolonizacja n = 170 (89%) potwierdzenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MT

37 chorzy na gruźlicę (1999-2005) metoda i wynik liczba chorych
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie chorzy na gruźlicę ( ) metoda i wynik liczba chorych AFB (+) hodowla (+) 62 AFB (-) hodowla (+) 51 AFB (+) hodowla (-) 20 * AFB (-) hodowla (-) 9 * ogółem 142 w próbkach / 51 chorych wynik testu MTD był ujemny We have owns 7-year experience with MTB test. Among 142 TB patients as many as 29 cases were recognized as M.tbc infected only by molecular test. 9 patients were AFB and culture negative. 20 patients were microscopically positive. But I would like to point out 9 of 51 culture posiive and simultaneously MTB negative from this same specimen We think that it is effect of different volumes of sample used in both tests and may be not enough homogenisity of samples. But fact is fact * dodatni test molekularny(MTB)

38 Systemy molekularne w diagnostyce gruźlicy
* Amplicor MTB (Roche Molecular System, Somerville, New Jersey) - w systemie rozpoznaje się M.tuberculosis complex PCR * Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD) test (Gen-Probe Inc. San Diego, Ca) – w systemie rozpoznaje się M.tuberculosis complex, M.avium complex, M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.gordonae, rRNA * BDProbe Tec ET Mycobacterium tuberculosis Complex Direct Detection Assay (SDA - Strand Displacement Amplification); (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.) - rozpoznaje M.tbc complex, M.avium complex oraz M.kansasii SDA

39 Wykrycie produktów reakcji
Amplicor MTB PCR (Roche) Próbka kliniczna Dekontaminacja Zagęszczanie Izolacja DNA PCR Wykrycie produktów reakcji

40 Mycobacterium tuberculosis complex :
Mycobacterium bovis Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium africanum Mycobacterium microti Do niedawna nierozróżnialne metodami biologii molekularnej dopuszczonymi do diagnostyki rutynowej

41 Porównanie czułości i czasochłonności metod laboratoryjnych w wykrywaniu gruźlicy
metody molekularne hodowle mikroskopia 70 – 90 % kilka godz. 70 % kilka dni - 8 tygodni 30 % 3 godz.

42 bk - próbka kliniczna (po wstępnym opracowaniu) metoda molekularna
bakterioskopia hodowla wynik bk - Tbc nie Tbc bk+ 24 h ujemna dodatnia test niacynowy lub metody molekularne M.kansasii MAC M.tuberculosis HPLC wynik kilkadziesiąt gatunków prątków M.tuberculosis kilkanaście dni do 10 tyg. wynik lekooporność met. hodowlane lub met. molekularne kilka godzin do 40 dni

43 Najczęstsze błędy laboratoryjne lub interpretacyjne w mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy
Jednoznaczna interpretacja mikroskopii bk (+) jako gruźlicy, może być to: * gruźlica * saprofit środowiskowy – (NTM / MOTT) * mykobakterioza * w przypadku materiałów bronchoskop., zanieczyszczenie instrumentarium

44 II Brak typowania do gatunku wyrośniętych szczepów prątków - poprzestanie na wykonaniu testu niacynowego różnicujacego jedynie M.tbc oraz MOTT nie pozwala to na: * diagnozowanie mykobakterioz * wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń prątkami środowiskowymi

45 Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy
III Zaniechanie wzywania na dodatkowe badania mikrobiologiczne chorych ze wskazaniami klinicznymi, u których wyhodowano prątki niegruźlicze Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy

46 IV    Brak systematycznej oceny mikrobiologicznej czystości sprzętu endoskopowego

47 Immunologiczna diagnostyka zakażenia M
Immunologiczna diagnostyka zakażenia M.tuberculosis w warunkach in vitro Diagnostyka uśpionych zakażeń M.tbc Latent Tuberculosis Infection - LTBI

48 Odpowiedź na zakażenie M.tuberculosis
cell mediated immunity nasilenie odpowiedzi przeciwciała replikacja prątków L a t e n t TB I n f e c t i o n czas choroba zakażenie

49 skórny test tuberkulinowy
Zjawisko, które było podstawą współcześnie stosowanego testu tuberkulinowego opisał w 1890 roku Robert Koch, kontynuatorami jego pracy byli Charles Mantoux i Clemens von Pirquet skórny test tuberkulinowy (tuberculin skin test -TST) stosowany jest od 1907 roku.

50 pomiar testu tuberkulinowego
IFN-γ test skórny IL- 8 TNF- komórka pamięci komórka prezentująca antygen IFN-γ TNF- IL- 8 krew - test in vitro pomiar produkcji IFN-γ

51 Czynniki negatywizujące TST:
Zależne od osoby badanej infekcje (wirusowe, bakteryjne, grzybicze) zaburzenia metaboliczne niedożywienie choroby narządów limfatycznych(np..białaczka, sarkoidoza) leki (glikokortykoidy, leki immunosupresyjne) wiek Zależne od preparatu tuberkulinowego nieodpowieednie rozcieńczenie chemiczna denaturacja adsorpcja na szkle kontaminacja Zła technika szczepienia Zła technika odczytu

52 ekspozycja na M.tbc gruźlica 5 -10 % brak dowodów zakażenia 5 %
zakażenie 95 % zakażanie uśpione % gruźlica % nie dochodzi do rozwoju choroby 90% wg E.Tortoli 2005

53 Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat
Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat stworzyły test alternatywny dla skórnego testu tuberkulinowego Jest to test in vitro nowej generacji mierzący poziom odporności komórkowej Podstawą testu jest oddziaływanie na komórki w warunkach in vitro wysoko swoistych dla M.tuberculosis antygenów ESAT-6 oraz CP-10 stymulujących wydzielanie IFN-gamma

54 ESAT-6 - early secretory antigenic target 6
CP culture filtrate protein niskocząsteczkowe białka swoiste dla M.tuberculosis Antygen NTM Antygen ESAT CFP ESAT-6 CFP-10 M abscessus - - M avium - - M branderi - - M celatum - - M chelonae - - M tuberculosis + + M fortuitum - - M gordonae - - BCG M intracellulare - - moreau - - M kansasii + + pasteur - - M malmoense - - M marinum + + tokyo - - M genavense - - danish - - M scrofulaceum - - glaxo - - M smegmatis - - montreal - - M szulgai + + M terrae - - - M vaccae - - M xenopi - -

55 QuantiFERON-TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S.
Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (Latent Tuberculosis Infection -LTBI) CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)

56 Quantiferon metoda probówkowa
1 krew inkubacja h w 37°C kontrola ESAT6 + CFP10 mitogen ujemna wirowanie kolor 2 DO 450nm badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny IFN-g IU/ml odczytanie stężenia z krzywej standardowej

57 Quantiferon – metoda płytkowa
ESAT-6 CFP-10 mitogen pobranie krwi krew + antygeny inkubacja 24h , wydzielenie IFN-γ KOLOR DO 450nm IFN-g IU/ml ‘sandwich’ ELISA, (incubacja 120 min) dodanie substratu, reakcja barwna odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej

58 QuantiFERONTB Gold – interpretacja wyników
miogen – K ESAT 6 – K i / lub CFP 10 – K wynik interpretacja  0,5  0,35 pozytywny zakażenie prawdopodobne < 0,5 < 0,35 negatywny nieprawdopodobne nieokreślony brak wyniku IU IFN- γ /ml

59 T SPOT- TB assay metoda ocena liczby komórek syntetyzujących IFN-γ
kontrola ESAT-6 CFP-10 mitogen pobranie krwi separacja leukocytów jednojądrzastych inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ kOLOR ‘sandwich’ ELISA, (Inkubacja 120 min) inkubacja 24 h w 37oC ocena liczby barwnych plamek

60 Jeżeli w kontroli negatywnej.>10 lub kontroli pozytywnej <20
test nie może być interpretowany

61 T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp. 59-64, (2004)
cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp , (2004) Figure 1. Dot plot of individual responses to CFP-10 and ESAT-6 for 118 culture-positive patients with tuberculosis (TB) (a), 213 subjects with a low risk for TB exposure (b), and 33 TB suspects whose TB status could not be determined, as Mycobacterium tuberculosis could not be cultured (c). *For "ESAT/CFP" the data for the antigen (ESAT-6 or CFP-10) giving the highest response is shown. The dashed line represents the cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ

62

63

64

65 ekspozycja na M.tbc gruźlica 5 - 10 % brak dowodów zakażenia 5 %
zakażenie 95 % zakażanie uśpione % gruźlica % nie dochodzi do rozwoju choroby 90% wg E.Tortoli 2005

66 QuantiFERON-TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S.
Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum. Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (LTBI). CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)

67

68 Schemat reakcji PCR DNA wyjściowe 1.Denaturacja termiczna
2.Przyłączanie primerów 3.Synteza nowej nici DNA (termostabilna polimeraza)

69 wydłużanie (synteza) nowej nici DNA przyłączanie primerów
PCR –Polymerase Chain Reaction Polimerazowa reakcja łańcuchowa *Powielenie wybranego fragmentu DNA w cyklicznej reakcji z wykorzystaniem primerów obejmujących (flanklujących) interesującą sekwencję * Każdy cykl reakcji składa się z trzech etapów sterowanych zmianami temperatury: wydłużanie (synteza) nowej nici DNA denaturacja przyłączanie primerów 94-95oC sek–1,5min 72oC sek–3min 40-60oC sek–2 min *liczba cykli 20 – teoretyczna liczba kopii DNA uzysklanych w reakcji PCR z 1 wyjściowej cząstki DNA = 2n (n-liczba cykli)

70 Wizualizacja wyników testu Amplicor - MTB opiera się na technice ELISA przy użyciu:
biotynylowanych primerów w reakcji PCR sondy genetycznej wiążącej swoiste DNA konjugatu awidyna - peroksydaza substratu tetrametylobenzydyny –TMB czas wykonania – 5-8 godzin

71 rRNA Mycobacteriun tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen Probe)
promotor-primer RT - odwrotna transkrypcja  rRNA/DNA rRNA rRNADNA degradacja rRNA przez RNA-zęH, RT,  DNA/DNA primer 2 polimeraza RNA tworzy kopie RNA na matrycy DNA kopii primer 2 promotor-primer RT RNA/DNA,degradacja rRNA,synteza nowej nici DNA,powrótdupleksu do cyklu

72 Wizualizacja testu Mycobacteriun tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen Probe) opiera się na:
* stosowaniu sond DNA znakowanych estrem akrydyny, które wiążą amplikony RNA * odrzuceniu sond niezwiązanych z RNA * odczycie wyników w luminometrze * Czas wykonanie – 6-8 godzin

73 SDA - Strand Displacement Amplification
Amplifikacja z przemieszczeniem łańcucha BDProbe Tec ET 2 5' 1 5' 5' 5' 1- DNA prątkowe 2-primer swoisty dla poszukiwanego DNA zawiera nukleotyd z siarką swoisty dla endonukleazy BsoB1 3- Duplex DNA (polimeraza Bst) 4- Endonukleaza BsoB1 tnie swoistą sekwencję. Ciecie nie jest efektywne (siarka!) 5- miejsce cięcia naprawia polimeraza DNA (Bst) 3 4 5 Efektywność amplifikacji – 109 kopii sekwencji swoistej

74 BD Prob Tec ET(c.d.) Detekcja produktów amplifikacji w teście odbywa się na zasadzie fluorescencji Zaletą systemu jest, że amplifikacja i detekcja (na zasadzie fluorescencji) odbywa się w stałej temperaturze * System ma wewnętrzną kontrolę pozytywną * Całkowity czas wykonania testu wynosi około 140 min. * Czułość 9 CFU/reakcję (125 CFU/ml) DNA swoiste separacja przestrzenna F1 i F2 emisja promieniowania czytnik przy braku wiązania ze swoistym DNA sygnał pobudzający F1 przenoszony jest na F2 (ET), który emituje światło o długości fali nie wykrywanej przez czytnik F1 F2 sonda

75 Amplicor MTB W badaniu próbek klinicznych, w których uzyskano wynik ujemny w badaniu molekularnym (PCR-MTB), w 12 przypadkach (1,7 %) uzyskano wzrost prątków M.tuberculosis w hodowli na pożywce L-J 12 przypadków gruźlicy / 900 wyników PCR (-) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii AM - badania diagnostyczne w okresie: marzec wrzesień 2003

76 PCR (+) hod. (+) 66% hod. (-) 34% 62 % bk (+) 19 % bk (+)
Porównanie czułości: met. molekularna (PCR-MTB-Roche) - hodowla - bakterioskopia plwociny popł.oskrzelowe płyny BAL wymazy z ran płyny opłucnowe 120 PCR (+) 100 hod. (+) 66% 80 60 hod. (-) 34% 62 % bk (+) 40 19 % bk (+) 20 Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii AM - badania diagnostyczne w okresie: marzec wrzesień 2003

77 czułość i swoistość testów molekularnych w diagnostyce gruźlicy
czułość */ swoistość*/ 70 – 90 % – 100 % */ w odniesieniu do hodowli dodatnich