Cytometria przepływowa

Prezentacja na temat: "Cytometria przepływowa"— Zapis prezentacji:

1 Cytometria przepływowa

2 FACS – Fluorescence activated cell sorting

3 FacsCalibur Producent – Becton Dickinson Rok produkcji 2010
System akwizycji danych rejestruje komórki lub cząstki biologiczne przepływające z częstością > 3000 na sek.

4 FacsCalibur Model dwulaserowy: laser argonowy – 488 nm
laser diodowy – 635 nm Czterokolorowy czyli 4 fluorescencje: FL1, FL2, FL3 i FL 4

5 Budowa Układ ciśnieniowo-cieczowy (pompa, zbiorniki, filtry) – zapewnia przepływ próbki przez aparat Układ optyczny (laser, pryzmaty, soczewki, filtry) – wzbudzanie i detekcja sygnałów z fluorochromów Układ elektroniczny (detektory, wzmacniacze) – przetwarzanie i obrazowanie danych

6

7 Układ ciśnieniowo-cieczowy
zawiesina komórek ciecz osłaniająca fluorescencja promień lasera wg Purdue University Cytometry Laboratories 7

8 Układ optyczny Zadania: Wzbudzanie fluorochromów (barwników)
Detekcja sygnałów z fluorochromów na odpowiednich fotopowielaczach(detektorach)

9 Układ elektroniczny Zadania:
- Przekazanie sygnału z detektorów do komputera. - Przetworzenie informacji na dane graficzne i statystyczne

10 Analiza cytometryczna określa:
Względną wielkość komórek oraz ich wewnętrzne zróżnicowanie Badanie struktur komórkowych wyznakowanych odpowiednimi układami przeciwciało-barwnik

11 Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni
Właściwości FSC i SSC Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni Detektor rozproszenia na wprost Laser Rozproszenie na wprost FSC mierzone wzdłuż osi padającego światła lasera określa wielkość komórki Rozproszenie boczne SSC mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej światło laserowe odbite i rozproszone określa gęstość i liczbę ziarnistości 11

12

13

14 Analiza wieloparametrowa
Do analizy i obrazowania danych stosuje się kilka typów wykresów: jednowymiarowe dwuwymiarowe perspektywiczne

15 Wykres jednowymiarowy – histogram
- analizuje intensywność fluorescencji jednego parametru

16 Wykres dwuwymiarowy - kropkowy, gęstości (każda kropka reprezentuje pojedynczą komórkę) - analizuje intensywność fluorescencji dwóch parametrów

17 Wykres perspektywiczny (trójwymiarowy)

18 Parametry mierzone cytometrem przepływowym
Strukturalne rozmiar kształt cytoplazmatyczne ziarnistości zawartość barwnika np. hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne, porfiryny aminokwasy fluoryzujące w białkach np. tryptofan, tyrozyna zawartość DNA, RNA, białek, lipidów, cukrów, powierzchniowych antygenów

19 Parametry mierzone cytometrem przepływowym
Funkcjonalne ładunek powierzchniowy ekspresję receptorów powierzchniowych integralność błony (żywotność - apoptoza) aktywność enzymów np. MPO

20 Kliniczne zastosowanie cytometrii przepływowej
Diagnostyka immunologiczna niedobory odporności – pierwotne i wtórne diagnostyka alergii in vitro diagnostyka schorzeń autoimmunologicznych transplantologia narządowa i komórkowa ocena subpopulacji limfocytów ocena stanu funkcjonalnego komórek

21 Kliniczne zastosowanie cytometrii przepływowej
Diagnostyka hematologiczna Diagnostyka onkohematologiczna fenotypowanie komórek białaczkowych i chłoniakowych analiza profilu DNA komórek nowotworowych – w trakcie chemioterapii wykrywanie choroby resztkowej

22 Zalety Jednoczesny pomiar wielu elementów tzw. „multiplexing” pojedynczych komórek Analiza populacji na zasadzie cell-by-cell Badanie całych komórek, jąder, mikrofragmentów komórkowych Materiał badawczy – krew obwodowa, szpik kostny, węzeł chłonny, PMR, BAL, fragment tkanki Oszczędność materiału Analiza dużej populacji komórek (dane zbierane co najmniej dla komórek na próbkę) Krótki czas analizy Zastosowanie do analizy o różnym charakterze (diagnozowanie choroby, monitorowanie terapii)

23