Spektroskopowe metody identyfikacji związków

Prezentacja na temat: "Spektroskopowe metody identyfikacji związków"— Zapis prezentacji:

1 Spektroskopowe metody identyfikacji związków
Spektrometria masowa

2 Spektrometria masowa (MS – Mass Spectrometry) to dynamicznie rozwijająca się metoda analizy instrumentalnej związków organicznych. Badany związek doprowadza się do jonizacji i rozpadu na naładowane fragmenty, które przyspiesza się polem elektrycznym. Uzyskany strumień jonów rozdziela się wg stosunku ich masy do ładunku i mierzy natężenie prądu jonowego odpowiadające poszczególnym jonom.

3 Zastosowanie spektrometrii masowej:
określanie masy atomowej związku chemicznego, badania strukturalne izomerów, badania strukturalne biopolimerów i związków pochodzenia naturalnego

4 Sprzężenie z chromatografią

5 Schemat ideowy

6 Metody jonizacji próbki:
- jonizacja strumieniem elektronów (EI), - jonizacja chemiczna (CI), - jonizacja polem (FI), bombardowanie szybkimi atomami (FAB) ESI (Elecrtospray Ionization) MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)

7 Jonizacja strumieniem elektronów (EI – Electron Ionization)
Konieczne jest przeprowadzenie badanej substancji w stan pary (poważna wada metody). W wyniku przejścia strumienia elektronów o energii 10-70eV przez pary substancji i wybiciu elektronu z molekuły powstaje kation rodnikowy

8 Jonizacja chemiczna (CI – Chemical Ionization)
Podobnie jak w przypadku EI konieczność przeprowadzenia związku w stan pary ogranicza mozliwość analizy takich substancji jak peptydy, cukry, białka. W metodzie tej wykorzystuje się tzw. jony pierwotne powstałe na skutek bombardowania elektronami gazu reagującego (np metan, izobutan, amoniak, woda). Jony pierwotne reagują następnie z cząsteczkami analizowanej substancji.

9 Jonizacja strumieniem elektronów a jonizacja chemiczna

10 Jonizacja polem (FI – Field Ionization)
Związek jest odparowywany w pobliżu dodatnio naładowanej elektrody co prowadzi do powstania kationu rodnikowego. Pierwsza metoda umożliwiająca analize peptydów i cukrów, jej wadą jest mała intensywność sygnałów.

11 Bombardowanie szybkimi atomami (FAB – Fast Atom Bombardment)
Próbka jest bombardowana strumieniem atomów argonu w wyniku czego uzyskuje się zarówno jony naładowane dodatnio jak i ujemnie. Badany związek jest rozpuszczany w ciekłej matrycy (gliceryna, glikole polietylenowe, etery koronowe). Najlepsza metoda badania makromolekuł pochodzenia naturalnego.

12 Wady metody: średnia czułość metody, problemy z analizą mieszanin, wraz ze zużyciem matrycy możliwość coraz większego jej wpływu na jakość widma. Zalety metody: szybkość i łatwość wykonania, łatwe do interpretacji widma, możliwość prostego regenerowania źródła atomów/jonów.

13 MALDI Próbka umieszczona w matrycy jest zdyspergowana
na powierzchni, a następnie ulega desorpcji i jonizacji na skutek działania laserem. Metoda ta jest stosowana głównie do sekwencjonowania peptydów i określania masy cząsteczkowej białek.

14 Przykładowe matryce N C O H 3 2 CHCA DHBA

15 Zalety metody: możliwość badania układów o masie dochodzacej do 300000Da, wysoka czułość, delikatna jonizacja, umożliwiająca małą fragmentację, tolerancja dla soli w stężeniu milimolowym, możliwość nadania mieszanin Wady metody: Stosowanie matryc może stanowić problem w pomiarach dla związków o masie poniżej 700Da, Możliwość fotodegradacji na skutek desorpcji/jonizacji laserem, stosowanie kwaśnych matryc może powodować rozpad Niektórych badanych substancji

16 ESI Technika stosowana do badania rozpuszczalnych w wodzie biomolekuł:
peptydów, białek, cukrów. Spektrometr masowy jest najczęściej sprzężony z LC. Próbka jest rozpylana i jonizowana za pomocą przyłożonego napięcia, rzędu kilku kV.

17 Zalety metody: uniwersalna metoda, umożliwiająca przeprowadzenie substancji z roztworu w formę zjonizowanego gazu, możliwość badania substancji rozpuszczonych w różnych rozpuszczalnikach, wysoka czułość, kompatybilność ze wszystkimi analizatorami, Wady metody: obecność soli i mieszanin może obniżać czułość, wymagana duża czystość próbki

18 Analizatory stosowane w spektrometrach masowych:
• analizatory magnetyczne, • analizatory kwadrupolowe, • analizatory mierzące czas przelotu jonów, • analizatory cyklotronowego rezonansu jonowego. Najistotniejsze cechy analizatora to: • rozdzielczość, • zakres mas cząsteczkowych w których można wykonywać pomiar, • czułość

19 Schemat analizatora

20 single mass transmission mode
mass scanning mode m1 m3 m4 m2 single mass transmission mode m2 m3 m1 m4

21 Pułapka jonowa

22 Budowa spektroskopu MALDI / TOF
Laser Reflektor Detektor Próbka w matrycy

23 Interpretacja widma masowego
Pik główny (podstawowy) – pik o największej intensywności określanej jako 100% Pik jonu molekularnego (macierzysty) M+ - odpowiada strukturze kationorodnika czyli masie badanego związku Piki izotopowe – towarzyszą jonom molekularnym, powstają w wyniku różnego składu izotopowego związku

24 W przypadku małych układów MS jest doskonalą metodą ich rozróżniania – można dokonać pomiaru masy z dokładnością do u C5H C4H8O M = M = Dla większych cząsteczek nie jest to już takie proste

25 Fragmentacje

26 Fragmentacje

27 Podstawowe reguły procesu fragmentacji:
w czasie fragmentacji łańcucha węglowodorowego faworyzowane jest rozrywanie wiązań C-C, najłatwiej następuje rozrywanie wiązań C-C w miejscach rozgałęzienia łańcucha, łatwo rozerwaniu ulegają wiązania C-C odległe o dwa wiązania od wiązania podwójnego, w pochodnych węglowodorów elektron jest odrywany zwykle od heteroatomu co sprzyja rozrywaniu sąsiadującego z nim wiązania

28 Fragmentacje

29 W czasie procesu fragmentacji powstają kationy najtrwalsze:
[CH3CH2CH3]+ → CH3CH •CH3 M+ = m/z = niewykrywalny Ale już dla nieco większych molekuł sytuacja komplikuje się

30

31 Jon molekularny M+ = 98 odpowiada wzorowi sumarycznemu C7H14
Pik podstawowy m/z = 83 co sugeruje utratę rodnika metylowego (15u) Pik podstawowy m/z = 69 co sugeruje utratę rodnika etylowego (29u)

32 Fragmentacje

33 Fragmentacje

34 Fragmentacje

35 Łagodne metody jonizacji
337 nm UV laser MALDI cyano-hydroxy cinnamic acid Gold tip needle Fluid (no salt) ESI + _

36 BIAŁKO Stosując określoną proteazę, można pociąć białko na określone
fragmenty np. w przypadku trypsyny w miejscach, gdzie znajduje się arginina i lizyna.

37 Pocięte fragmenty białka
mają określoną masę, która może być zmierzona za pomocą MS 95.4 89.3 112.1 105.3 = 402.2 Lista tych mas jest używana jako wzorzec i daje możliwość określenia sekwencji białka. 95.4 89.3 112.1 105.3 97.1 101.8 = 601

38 = fingerprint Lista mas dla pików
Każdy pik odpowiada określonej masie (m/z) powstającego jonu Lista mas dla pików 112.1 234.4 890.5 1296.9 1876.4 1987.5 ……. = fingerprint

39 Budowa tandemowego spektrometru masowego MS/MS
Pierwszy analizator Komora kolizyjna Drugi analizator Rejestrator Próbka Wybrany jon m/z Fragmentacja jonu macierzystego

40 Określanie sekwencji aminokwasowej peptydu
N-końcowe jony C-końcowe jony

41 Protein ID/Characterization
Zastosowanie MS do analizy peptydów i białek Protein or Protein mixture Electrospray Ionization Protein Ions Precursor Ion isolation Isolated Precursor Ion Dissociation Mass analysis of Protein Fragment Ions Fragment ions spectrum generation Database interrogation or “de novo analysis” Protein ID/Characterization