Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów

Prezentacja na temat: "Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów"— Zapis prezentacji:

1 Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów

2 Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów
Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu - określenie przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku Gatunek - populacja mikroorganizmów wykazujących wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się od innych gatunków tego samego rodzaju

3 Identyfikacja taksonomiczna bakterii
Szczep – grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki Szczep referencyjny – izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec) Gatunek – wiele szczepów podobnych w ściśle określonym zakresie cech Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujących co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA

4 Identyfikacja taksonomiczna bakterii
Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe nG + nC % G+C = x 100% nA + nT + nC + nG W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10%

5 Cechy umożliwiające identyfikację bakterii
morfologia skład chemiczny ściany komórkowej obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych zdolność do tworzenia pigmentów sposób odżywiania wymagania pokarmowe źródła C, N, S skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji wymagania tlenowe zakres temperatur i pH wzrostu wrażliwość na antybiotyki patogenność zależności symbiotyczne z innymi organizmami środowisko występowania obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna) sekwencja DNA genomowego

6 Metody identyfikacji mikroorganizmów
Podział metod identyfikacji mikroorganizmów: a) biochemiczne b) biofizyczne c) biologii molekularnej d) immunochemiczne

7 Metody biochemiczne Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo wzrost lub jego brak zmiana zabarwienia pożywki reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem wytworzenie gazu

8 Testy biochemiczne Zawieszenie Naniesienie INKUBACJA (18 – 48 h)
Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)

9 Metody biofizyczne Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznaczanie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych Techniki elektroforetyczne Techniki oparte na chromatografii gazowej

10 Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych
Analiza profili białkowych skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek komórkowych Sposób postępowania: izolacja białek komórkowych rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym barwienie rozdzielonych białek porównanie z profilami białkowymi bazy danych Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

11 Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych
Elektroforeza dwukierunkowa

12 Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową
Analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ściany komórkowej skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla każdego gatunku mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli zarówno ilościowy, jak i jakościowy skład ściany komórkowej bakterii kodowany jest przez DNA genomowe i nie ma na niego wpływu informacja genetyczna zawarta w plazmidach Analiza jakościowa – obecność specyficznych kwasów tłuszczowych Analiza ilościowa – określenie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych

13 Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową
Sposób postępowania: saponifikacja i uwolnienie kwasów tłuszczowych metylowanie ekstrakcja z fazy wodnej rozdział z zastosowaniem chromatografii gazowej analiza wyników i porównanie z bazą danych Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

14 Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową
Microbial Identification System HP 5898 A firmy Hewlett Packard

15 Metody biologii molekularnej
Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów kwasów nukleinowych Metody hybrydyzacyjne Metody oparte o technikę PCR

16 Metody hybrydyzacyjne
Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych sondy są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA, zawierające sekwencje unikalne dla danego organizmu kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest znakowany radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H] barwnikiem fluorescencyjnym enzymem

17 Metody hybrydyzacyjne
Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystują sondy DNA komplementarne do charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA) Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, gdyż występuje on w komórce bakteryjnej w dużej liczbie kopii (od do ) Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępność informacji odnośnie sekwencji rRNA pochodzących od różnych, często bardzo blisko genetycznie spokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej specyficzności

18 Metody hybrydyzacyjne
Dot blot

19 Metody hybrydyzacyjne
Southern blotting

20 Metody hybrydyzacyjne
homologia kwasów nukleinowych powyżej 60% świadczy o przynależności organizmu do określonego gatunku stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego drobnoustroju z danym rodzajem hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić między DNA lub RNA organizmów niespokrewnionych

21 FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem

22 FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ
Wynik FISH dla mieszaniny wybranych bakterii z rodzaju Bacillus, Escherichia, Pseudomanas, Shigella

23 Metody wykorzystujące technikę PCR
Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) - enzymatyczna amplifikacja (zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów gen kodujący 16S rRNA mikroorganizmów prokariotycznych gen kodujący 18S rRNA mikroorganizmów eukariotycznych Sposób postępowania: amplifikacja fragmentu DNA sekwencjonowanie porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów 5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku

24 Metody wykorzystujące technikę PCR badanie mieszanej populacji mikroorganizmów

25 Metody wykorzystujące technikę PCR
Geny kodujące białka bakteryjne białko szoku termicznego Hsp 70 białko szoku termicznego Hsp 60 syntaza asparaginylo-tRNA syntaza alanylo-tRNA dehydrogenaza glutaminianowa hydrolaza pirofosforanu podjednostka β polimerazy RNA (RpoB) podjednostka β’ polimerazy RNA (RpoC) czynniki elongacyjne: EF 1α/Tu, EF-Tu, Ef-G/2 białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12 gyrazy

26 Metody immunochemiczne
Reakcja aglutynacji

27 Metody immunochemiczne
Test ELISA

28 Metody immunochemiczne
Test immunochromatograficzny