Aktinoryza i jej znaczenie

Prezentacja na temat: "Aktinoryza i jej znaczenie"— Zapis prezentacji:

1 Aktinoryza i jej znaczenie

2 Aktinoryza to symbioza pomiędzy wiążącym azot promieniowcem z rodzaju Frankia oraz korzeniami niektórych drzew i krzewów okrytonasiennych. Wiązanie azotu odbywa się w aktinoryzowych brodawkach indukowanych przez Frankia na korzeniach roślin aktinoryzowych. Wiązanie azotu przez rośliny aktinoryzowe może osiągać wydajność od 2 do 360 kg N/ha/rok co jest .porównywalne z wydajnością tego procesu u roślin motylkowych żyjących w symbiozie z Rhizobium. Azot związany przez Frankia jest dostarczany roślinie-gospodarzowi, a także jest wydzielany do gleby, dzięki czemu uzupełnia niedobory azotu. Aktinoryza jest procesem ważnym w gospodarce leśnej i w procesie rekultywacji gleby.

3 Rośliny aktinoryzowe – makrosymbiont
Frankia tworzy symbiozę z ok. 220 gatunkami dwuliściennych roślin okrytozalążkowych należących do 23 rodzajów i 8 rodzin (m.in. Casuarinaceae, Myricaceae, Eleagnaceae, Rhamnaceae, Betulaceae). Najważniejszą rośliną aktinoryzową w Polsce jest olsza Alnus sp.

4

5 Przykłady roślin aktinoryzowych, innych niż olsza:
Casuarina (Australia)

6 Woskownica (Myrica; ang.: bayberry)
Oliwnik (Eleagnus)

7 Olsza, podobnie jak inne gatunki aktinoryzowe, należy do tzw
Olsza, podobnie jak inne gatunki aktinoryzowe, należy do tzw. roślinności pionierskiej; zasiedla tereny ubogie w azot jak gleby piaszczyste, żwirowate, mokradła, nieużytki, gleby zdegradowane. Sugeruje się użycie tej rośliny jako rotacyjnej, poprawiającej jakość gleby, lub jako domieszkę w lasach składających się z drzew szczególnie ważnych z ekonomicznego punktu widzenia (sąsiedztwo olszy korzystnie wpływa na wzrost innych drzew). Przykład:

8 Frankia – mikrosymbiont
Frankia jest Gram-dodatnim, powoli rosnącym, tlenowym promieniowcem o strzępkach podzielonych poprzecznymi przegrodami. Grzybnia promieniowca tworzy charakterystyczne terminalne zgrubienia, zwane „pęcherzykami”. Pęcherzyki otoczone są wielowarstwową ścianą zbudowaną z lipidów. Kształt pęcherzyków jest zależny od żywiciela. U Alnus mogą być kształtu buławkowatego, pałeczkowatego lub sferycznego. Wewnątrz pęcherzyków odbywa się wiązanie azotu.

9 Schemat budowy przykładowego pęcherzyka (za Małek, 1993):

10 Obok grzybni i pęcherzyków Frankia tworzy sporangia z nieruchliwymi sporami. Sporangia mogą być okrągłe lub nieregularne, a także wielokomorowe, podzielone przegrodami poprzecznymi i podłużnymi.

11 Wewnątrz brodawek olszy, jak i w czystej kulturze, Frankia może tworzyć wszystkie trzy struktury morfologiczne: grzybnię, pęcherzyki i sporangia (pęcherzyki nie powstają w pożywkach zawierających azot związany; znane też są brodawki Sp(-) nie zawierające spor lub jedynie nieliczne spory). W brodawkach pęcherzyki występują w skupieniach, tzw. „vesicle clusters”.

12 Pierwsza publikacja o izolacji Frankia z korzeni Alnus glutinosa w Polsce:

13 Uzyskany szczep Frankia, wykazywał wszystkie cechy typowe dla symbiontów aktinoryzowych:,

14 .....z tworzeniem sporangiów, pęcherzyków oraz ich skupisk („vesicle clusters”):

15 Proces brodawkowania Sposoby infekowania korzeni roślin przez Frankia są zależne od gatunku gospodarza. U olszy w kontakcie z Frankia następuje skręcanie włośników i ich deformacja. Frankia namnaża się wewnątrz włośników i otacza tkanką rośliny-gospodarza. Namnażanie się wewnątrz korzenia zbiega się w czasie z wytwarzaniem komórek miękiszu korowego, co uwidacznia się nabrzmieniami na korzeniach, zwanych przedbrodawkami. Wskutek dalszego rozwoju brodawek tworzą się pierwotne płaty brodawkowe; są to zmodyfikowane korzenie boczne.

16 Przekrój podłużny przez płat brodawki Casuarina, zabarwiony floroglucynolem. Widoczne są silnie zabarwione, zlignifikowane strefy infekcji przez Frankia [wg R. H. Berga, cyt. za Bensonem (2008)] Aktinoryzowe brodawki są strukturami wieloletnimi (3-10 lat) z rocznym cyklem wzrostu i starzenia się. Najmłodsza, najbardziej aktywna tkanka jest zlokalizowana na obrzeżach płata brodawki. Brodawki olszy są zwarte; mogą osiągać znaczną wielkość (do kilku cm średnicy).

17 Przykłady brodawek różnych gatunków olszy:

18

19 Cytologia i ultrastruktura brodawek:
Pęcherzyki sferyczne w komórkach brodawek olszy Silniejsze powiększenie przekroju brodawki olszy; widać septy w pęcherzykach

20 Brodawki u różnych roślin aktinoryzowych (kolejno od lewej):
Casuarina glauca, Alnus incana subsp. rugosa, Casuarina sp., Morella pensylvanica Efektywność brodawkowania i wiązania azotu atmosferycznego jest uzależniona od wielu czynników środowiskowych (może być osłabiona przez nadmiar azotu nieorganicznego, suszę, obniżenie temperatury, zbyt niskie pH, brak fosforu i innych biopierwiastków, nieobecność innych drobnoustrojów ryzosferowych). Proces brodawkowania znajduje się pod kontrolą czynnika hormonalnego (istotne znaczenie mają zwłaszcza auksyny i cytokininy).

21 Wiązanie azotu. Frankia wiąże azot w pęcherzykach symbiotycznych
Wiązanie azotu Frankia wiąże azot w pęcherzykach symbiotycznych. Pęcherzyki zawierają enzym FeMo nitrogenazę. Jest on nieodwracalnie inaktywowany przez tlen u wszystkich organizmów wiążących azot atmosferyczny. Uważa się, że u Frankia ściana komórkowa pęcherzyków chroni enzym przed inaktywującym działaniem tlenu. Azot związany w symbiozie aktinoryzowej jest przenoszony do rośliny jako NH3 / NH4+. NH3 może być toksyczny, jeśli zostaje zakumulowany. Jednak w obojętnym pH komórki szybko przechodzi w NH4+ i jest asymilowany przez roślinę drogą: syntaza glutaminianowa – glutaminiano-oxo-glutarowy system aminotransferaz. W reakcjach transaminacji powstaje cytrulina, najważniejszy związek azotowy transportowany w ksylemie rośliny.

22 Mechanizmem pozyskiwania energii wewnątrz brodawek jest hydrogenaza.
Aktywność nitrogenazy w brodawkach korzeniowych jest uzależniona od aktywności fotosyntezy w liściach, co sugeruje ścisły związek obu procesów. Przypuszcza się, że molibden w cząsteczce nitrogenazy, w warunkach in vitro może być zastąpiony przez wanad, mangan lub chrom. Podstawowe reakcje wiązania azotu przez Frankia, można wg Bensona (2008) przedstawić następująco (vide nast. przeźr.):

23 Frankia, podobnie jak i inne bakterie diazotroficzne, wytwarza hydrogenazę, która umożliwia odzyskanie części elektronów – straconych wskutek produkcji H2 przez nitrogenazę (Benson, 2008).

24 Dzięki efektywnemu wiązaniu azotu przez Frankia, rośliny aktinory-zowe są organizmami pionierskimi – mogącymi zasiedlać środowis-ka skrajnie ubogie w azot:

25

26 Poprawę wzrostu siewek olszy na podłożach bezazotowych, można uzyskać nie tylko w drodze szczepienia czystą kulturą Frankia – ale także zawiesiną zmiażdżonych brodawek:

27 Szczepienie Frankia, umożliwia wykorzystywanie przez roślinę-gospodarza biopierwiastków zawartych w skałach takich, jak bazalt – wskutek wietrzenia skał:

28 Izolowanie Frankia Frankia występuje najliczniej w glebach porośniętych brodawkującymi roślinami aktinoryzowymi, ale promieniowca znajdowano także w glebach pozbawionych roślin żywicielskich (w tym także w środowiskach ekstremalnych, jak gleby zasolone, kwaśne, mokradła, wydmy). Liczebność Frankia w glebie określa się pośrednio przy użyciu metody brodawkowania. Bezpośrednie izolacje Frankia z gleby bardzo rzadko kończą się sukcesem. Zazwyczaj Frankia izoluje się z brodawek korzeniowych. Istnieją trzy główne przyczyny, z powodu których izolacja i hodowla są utrudnione: (1) długi czas wzrostu Frankia, (2) specyficzne wymagania odżywcze, (3) obecność innych mikroorganizmów w brodawkach. Pozycja taksonomiczna Frankia wg Bensona (2008):

29

30 Znane są następujące metody izolowania Frankia:
-          seryjnych rozcieńczeń, -          mikrosekcji, -          selektywnej inkubacji, -          wirowania w gradiencie sacharozy, -          filtracji. Metoda filtracji Bensona (1982) jest uważana za najbardziej wydajną procedurę izolacji. Opiera się na stwierdzeniu, że skupienia pęcherzyków („vesicle clusters”), uwolnione z tkanek brodawki w trakcie ich homogenizacji, mają około μm średnicy. W czasie filtracji tkanki brodawek zatrzymują się na filtrze o porach 50 μm, a skupienia pęcherzyków na 20 μm oczkach.

31 Dr David R. Benson, Professor of Microbiology, Department of Molecular & Cell Biology U-3125, University of Connecticut, Storrs, CT , Phone: ,

32 Mikroorganizmy inne niż Frankia zostają oddzielone od pęcherzy-ków w trakcie przemywania sterylną wodą destylowaną. Materiałem zebranym z filtra o porach 20 μm szczepi się bezazotowe pożywki dla Frankia. Po 4-8 tygodniach inkubacji w temperaturze 25-30C można zaobserwować charakterystyczny dla promieniowców wzrost. Izolaty zalicza się do Frankia na podstawie 5 kryteriów: 1. morfologia (wytwarzanie pęcherzyków i sporangiów) 2. budowa chemiczna ściany komórkowej i błon komórkowych 3. serologia 4. homologia DNA 5. infekcyjność i / lub efektywność w symbiozie z rośliną żywicielską.

33 Uproszczone kryteria dotyczą morfologii, zdolności wiązania azotu oraz zdolności do infekcji roślin żywicielskich i tworzenia efektywnych symbioz. =================================================== Przykładowe hodowle wytrząsane Frankia – w kolbach – bez (po lewo) i z dodatkiem polimeru Carbopol (po prawo):

34 Część praktyczna

35 Materiał: brodawki korzeniowe olszy czarnej Alnus glutinosa,
wiążący azot szczep Azospirillum (kontrola pozytywna) Badanie aktywności nitrogenazy w brodawkach (metodą redukcji acetylenu): - - do badania użyć świeżych brodawek, --- oddzielić poszczególne płaty brodawek i umieścić w trzech probówkach o pojemności 12 cm3 po 3,5 g lub - w przypadku mniejszej ilości materiału- w probówkach o pojemności 2,5 cm3 po 0,8 g (brodawki wypełniają probówkę do połowy jej wysokości), - - probówki zamknąć szczelnie gumowymi, sterylnymi korkami "serum stopper", - - w jednej z trzech probówek sprawdzić wolną pojemność probówki (wlewając do brodawek ilościowo wodę "pod korek" przy użyciu   

36 pipety szklanej o pojemności 10 cm3) - z dwóch pozostałych probówek usunąć strzykawką powietrze i wprowadzić acetylen (nową strzykawką) tak, aby stanowił on 10% całkowitej wolnej pojemności probówki, - po 2 godz. inkubacji w temperaturze 30C pobrać z probówek 1 ml (lub 0,2 ml) próbki gazowe i zbadać w nich zawartość etylenu przy użyciu chromatografu gazowego (kolumna o wymiarach 2 m x 1,8 mm wypełniona Porapak R, mesh, temperatura kolumny 700C, dozownika i detektora 1000C, gaz nośny azot z przepływem 40 cm3/min, detektor FID), - zanalizować dane przy użyciu programu komputerowego: "Chrom-Anal", - obliczyć wg wzoru Martennsona ilość nm etylenu/próbkę/godz, a następnie przeliczyć ilość etylenu na 1 g świeżej masy brodawek:

37 A= % C2H4/100 x [(PV/RT) x 109] / t A - aktywność nitrogenazy (nm C2H4/próbkę/godz), % C2H4 - % powierzchni piku etylenu z chromatografu gazowego, P- ciśn. atmosferyczne (~ 1,0 atm) V- objętość acetylenu (C2H4) wstrzykniętego do probówki (ml), R- stała gazowa = 82,054 ml x atm/mol/K, T - temperatura w stopniach Kelvina (273 + C) t - czas inkubacji próbki z acetylenem (Schemat badania – poniżej)

38

39 2.  Badanie wiązania azotu przez szczep Azospirillum:
- - do badania użyć szczepu wyhodowanego w bezazotowej pożywce Rennie (pożywka nie zaszczepiona będzie stanowiła "ślepą próbę"), -  - zastąpić korek z waty na sterylny "serum stopper", -  - z probówki za pomocą strzykawki usunąć 0,7 cm3 powietrza (10%) znad pożywki i dodać taką samą ilość acetylenu, -    - inkubować hodowlę w 30C przez 2 godz. (lub dłużej) -  - do dozownika chromatografu gazowego wstrzyknąć 1 cm3 próbki gazowej pobranej znad pożywki, zbadać w próbce zawartość etylenu, - aktywność nitrogenazy wyrazić w nmolach etylenu/hodowlę/godzinę wg wzoru Martennsona.

40 3. Izolowanie Frankia metodą filtracji Bensona
-    - oddzielone płaty brodawek przepłukać pod bieżącą wodą -  przeprowadzić powierzchniową sterylizację brodawek używając 2,5% podchlorynu sodu (zastosować preparat Ace w rozcieńczeniu 1:1, do rozcieńczenia użyć sterylnej wody destylowanej), do podchlorynu dodać kroplę Tween 20, brodawki wytrząsać na mieszadle magnetycznym przez 25 min., (schemat – poniżej): l

41 Czas 25-minutowego mieszania brodawek przy sterylizacji powierz-chniowej brodawek – proszę wykorzystać na liczenie kolonii na płytkach z ćwiczenia 2!

42 -  brodawki przepłukać 5-krotnie niewielką ilością wody sterylnej,
- w sterylnych warunkach pociąć brodawki na bardzo drobne kawałki, odrzucając wierzchołki, - przeprowadzić homogenizację skrawków brodawek w sterylnym, szklanym homogenizatorze w niewielkiej ilości sterylnej wody,  - filtry o porach 50 i 20 μm wysterylizować 1% podchlorynem sodu - 1 min., po czym kilkakrotnie przepłukać sterylną wodą, - homogenat przefiltrować przez oba filtry stosując do przepłukiwania duże ilości sterylnej wody, - materiał z filtra o porach 20 μm, będący właściwym inokulum, przenieść do sterylnej probówki, - sprawdzić obecność pęcherzyków Frankia ("vesicle clusters")

43 w zawiesinie pod mikroskopem, - uzyskaną zawiesiną zaszczepić 10 probówek z bezazotową pożywką dla Frankia.

44 Główne źródło ilustracji i innych informacji: Benson D. R
Główne źródło ilustracji i innych informacji: Benson D.R., 2008: Frankia & Actinorhizal Plants. Copyright  D. R. Benson, Department of Molecular & Cell Biology, University of Connecticut, Storrs, CT (19.X.2008)

45 Literatura Akkermans A.D.L., Hafeez Z., Roelofsen W., Chaudhary A.N., Ultrastructure and nitrogenase activity in pure culture and in actinorhizas of Alnus, Colletia and Datisca spp. [w] Advances in Nitrogen Fixation Research, red. C. Veeger, W.E. Newton, Nijhoff/Junk Pudoc, The Hague, s (cyt. za Małek, 1993) 2. Benson, D. R Isolation of Frankia strains from alder actinorhizal root nodules. Appl. Environ. Microbiol. 44: 3. Benson D.R., 2008: Frankia & Actinorhizal Plants. Copyright  D. R. Benson, Department of Molecular & Cell Biology, University of Connecticut, Storrs, CT (19.X.2008)

46 4. Dahm H. , 2000. Aktinoryza i mikoryza na korzeniach olszy. Wyd
4. Dahm H., Aktinoryza i mikoryza na korzeniach olszy. Wyd. IBL i CZLP, str 5. Król M.J., Zielewicz-Dukowska J., Genetyczne aspekty wiązania N2 bakterii z rodzaju Azospirillum. Post. Mikrobiol., 44(1): 6. Li C.Y., Bormann B.T., and Chang T.T., Restoration of degraded soil ecosystems and maintenance of long-term site productivity by actinorhizal plants. In Jamaluddin Jamaluddin (ed.) Biofertilizers. pp 7. Li C. Y., Strzelczyk E., and Pokojska A., Nitrogen-fixing endophyte Frankia in Polish Alnus glutinosa (L.) Gaertn. Microbiol. Res. 151:

47 8. Małek W., Symbioza roślin okrytozalążkowych z Frankia, promieniowcem wiążącym azot atmosferyczny. Post. Mikrobiol., 32(4): 9. Marcinowska K., Promieniowce wiążące azot atmosferyczny [w] Drobnoustroje w środowisku – występowanie, aktywność i znaczenie. W. Barabasz i J. Grzyb. (red.): Wyd. AR Kraków. 10. Strzelczyk E., Znaczenie aktinoryzy dla leśnictwa. Sylwan, 144(4): 7-15. ==================================================== Filmy (a raczej „filmiki”) nt. aktinoryzy i Frankia na str. D.R. Bensona: „Vesicles – The Movie” (monitoring hodowli Frankia) „3-D Hyphae in Datisca cells” (rekonstrukcja z mikr. konfokalnego)

48 Dziękuję za uwagę ;-)