Metoda ekspresji i oczyszczania białka eIF4E jako

Prezentacja na temat: "Metoda ekspresji i oczyszczania białka eIF4E jako"— Zapis prezentacji:

1 Metoda ekspresji i oczyszczania białka eIF4E jako
białka fuzyjnego z reduktazą dihydrofolianową Gosh P.,Cheng J., Chou T,Jia Y., Avdulov S., Bitterman P.B., Polunovsky V.A., Wagner C.R. „Expression, purification and characterization of recombinant mouse translation initiation factoe eIF4E as a dihydrofolate reductase (DHFR) fusion protein” Protein Expression and Purification 60 (2008) Dorota Kubacka

2 Funkcje eukariotycznego czynnika translacyjnego 4E – eIF4E
eksport wybranych mRNA z jądra do cytoplazmy inicjacja translacji zależnej od kapu inicjacja translacji wielu wirusowych VPg-mRNA Goodfellow at al., (2008) Int J Biochem Cell Biol 40,

3 Mechanizmy regulacji inicjacji translacji
Sonenberg at al., (2009) Cell 136,

4 Obszary badań związane z regulacją inicjacji
translacji mRNA poznanie mechanizmów regulacyjnych inicjacji translacji negatywne zmiany ilości i aktywności inicjacyjnych czynników translacyjnych, regulatorowych czynników translacji, tRNA zmiany chorobotwórcze (nowotworowe) mechanizm uczenia się i pamięci proces starzenia się nieprawidłowy rozwój organizmu …

5 Peptydy i białka pełniące rolę etykietek

6 Zalety i wady etykietek
ułatwiają oczyszczenie rekombinowanych białek zwiększają wydajność ekspresji białka (np.: GST, MBP, NusA, Ubiquitin) ułatwiają zwijanie się białka( np.: SUMO) zwiększają rozpuszczalność białka( np.: MBP, NusA, SET) wysoka specyficzność do ligandu niskie koszty złoża (np.: GST, MBP, His6) … Wady: powodują zmianę konformacji białka obniżają wydajność ekspresji białka wysokie koszty złoża

7 Enzymy stosowane w procesie usuwania etykietek

8 Metody ekspersji i oczyszczania białka eIF4E
oczyszczanie obecnego w supernatancie eIF4E na kolumnie m7GDP-agarose/m7GTP-Sepharose elucja: m7GTP lub wysokim stężeniem soli wydajność: do 2.5 mg z 1L kultur bakterii indukcja prowadzona w 15ºC – 7-10 mg z 1L kultur bakterii oczyszczanie nierozpuszczalnej frakcji białka eIF4E denaturacja w 6 M GdnHCl renaturacja w procesie 1 stopniowej dializy wydajność: 100 – 200 mg z 1L kultur bakterii oczyszczanie GST-eIF4E renaturacja poprzez 20 krotne szybkie rozcieńczenie frakcji zdenaturowanej oczyszczanie GST-eIF4E na kolumnie z glutathion-Sepharose wydajność: 200 –500 mg z 1L kultur bakterii

9 Fuzyjne białko DHFR-eIF4E
Cel pracy: uzyskanie czystego, w pełni funkcjonalnego, wolnego od kapu białka eIF4E Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60,

10 DHFR – reduktaza dihydrofolianowa
18 kDa białko przeprowadza reakcje redukcji kwasu dihydrofoliowego do kwasu tetrahydrofoliowego

11 Ekspresja białka DHFR(L54F)-eIF4E
gospodarz: E. Coli BL21(DE3) plac I Tuner 3.5h indukcja 0.2 mM IPTG w 37°C przy OD600= 0.4 MW IPTG + - SN pellet DHFR(L54F)-eIF4E Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60,

12 Metotreksat – jeden z inhibitorów reduktazy dihydrofolianowej
DHFR – reduktaza dihydrofolianowa Metotreksat inhibitor DHFR, hamuje syntezę kwasów nukleinowych wiąże się z DHFR 10 tys. razy silniej niż kwas foliowy stosowany jako lek min. w chorobach nowotworowych

13 Oczyszczanie białka DHFR-eIF4E na kolumnie
MTX-agarose Wiązanie białka do kolumny : pH 6.0 Warunki elucji DHFR-eIF4E: 10 mM KH2PO4, 0.1 mM K2EDTA, 1 M KCl, 1 mM DTT, pH 9.0, 3 mM kwas foliowy Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60,

14 Oczyszczanie białka eIF4E
oczyszczanie DHFR-eIF4E na kolumnie DEAE dializa DHFR-eIF4E do buforu aktywności enzymatycznej dla Trombiny: 50 mM Tris, pH 8.0, 0.1 M NaCl, 2.5 mM CaCl2 proces cięcia sekwencji białkowej linkera przez Trombinę w ciagu 20h, 4 °C oczyszczanie eIF4E na kolumnie jonowymiennej DEAE Elucja prowadzona gradientem soli M KCl w buforze: 20 mM Tris, 1mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.4 Wydajność: ~2.5 mg białka eIF4E z 2L hodowli Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60,

15 Aktywność białka eIF4E i DHFR-eIF4E
FE – intensywność florescencji białka bez kapu FEL – intensyność fluorescencji białka z kapem ET – całkowite stężenie enzymu LT – całkowite stężenie ligandu KD – stała dysocjacji wiązania białko-kap Warunki pomiaru: 50 mM Hepes pH 7.2, 100 mM KCl, 1mM DTT, 0.5 mM Na2EDTA, T = 22 °C, λwzb = 280 nm, λobs = 342 nm

16 Aktywność rekombinowanego białka eIF4E i DHFR-eIF4E
w inicjacji translacji translacja in vitro mRNA lucyferazy Renilla w lizacie z retikulocytów króliczych Ghosh at al., (2008) Protein Expr. Purif. 60,

17 Zalety i wady opracowanego systemu ekpsresyjnego
oczyszczanie fuzyjnego białka DHFR(L54F)-eIF4E na kolumnie MTX-agarose złoże jest stabilne, wysoka pojemność złoża ~80 mg/ml wysoka selektywność metotreksatu (MTX) niskie koszty zależność wiązania białka DHFR(L54F) z metotreksatem od pH; wiązanie – pH = 6.0, elucja – pH ~ 9 brak kontaktu z kapem białko nie jest renaturowane białko meIF4E zachowuje swoja aktywność wady docelowe białko może być niestabilne w wybranych warunkach pH

18 Zastosowanie eDHFR-eIF4E w żywych komórkach
reduktaza dichyrofolianowa z E. coli TMP – trimetoprim – syntetyczny inhibitor bakteryjnej reduktazy dihydrofolianowej TMP wykazuje wysoką specyficzność do eDHFR w porównaniu ze ssaczym białkiem DHFR funkcje taga pełnią fluorescencyjne pochodne trimetoprimu Miller at al., (2005) Nature Methods 2 (4),

19 Fluorescencyjne pochodne trimetoprimu TMP_hexachlorofluoresceina
TMP_fluoresceina TMP_hexachlorofluoresceina Calloway at al., (2007) ChemBioChem 8,

20 Selektywne znakowanie w żywych komórkach
Linia komórek U2OS (human osteosarcoma cell) znakowanie białkiem GFP zlokalizowanym jądrowo znakowanie białkiem eDHFR : TMP_hexachlorofluoresceina zlokalizowanym w błonie komórkowej Calloway at al., (2007) ChemBioChem 8,