Poziom stężeń analitów w moczu (literatura) [mg/L]

Prezentacja na temat: "Poziom stężeń analitów w moczu (literatura) [mg/L]"— Zapis prezentacji:

1 Poziom stężeń analitów w moczu (literatura) [mg/L]
Zastosowanie HPLC i elektroforezy kapilarnej do oznaczania wybranych metabolitów katecholamin w płynach ustrojowych Izabela Naczelnik Kierownik pracy: dr Ewa Poboży Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii Wprowadzenie Oznaczenia neuroaktywnych analitów takich, jak metabolity katecholamin, do których należą kwas homowanilinowy (HVA), stanowiący główny metabolit adrenaliny i noradrenaliny, kwas wanilinomigdałowy (VMA) metabolit dopaminy, kwas 5,5-hydroksy-indolooctowy (5HIAA) i kwas dihydroksyfenylooctowy (DOPAC) metabolity serotoniny są istotne w diagnozowaniu anomalii w funkcjonowaniu centralnego i obwodowego układu nerwowego. Podwyższone stężenie tych w płynach ustrojowych świadczyć może np. o obecności nerwiaka płodowego lub guza chromochłonnego. Szybka i trafna diagnoza szczególnie w pediatrii stanowi podstawę prawidłowej terapii. Nerwiak zarodkowy stanowi ok. 5 – 8 % nowotworów u dzieci, dlatego też szczególnie pożądana jest metoda analityczna pozwalająca masowo i niskim kosztem monitorować stężenie metabolitów katecholamin w moczu u noworodków. Istotne jest wczesne wykrycie guzów hormonalnie czynnych, gdyż są one wtedy wyleczalne. Cel pracy Celem pracy było oznaczenie wybranych metabolitów katecholamin z zastosowaniem HPLC i elektroforezy kapilarnej w płynach ustrojowych. Pierwszym etapem był dobór warunków rozdzielenia w roztworach wzorcowych. Do oznaczania analitów w próbkach naturalnych konieczne było wstępne oczyszczenie z przeszkadzających składników matrycy. Ostatnim etapem było oznaczenie kwasów w próbce oczyszczonego moczu i porównanie otrzymanych wyników z rozdzielenia chromatograficznego i elektroforetycznego. Katecholaminy i ich metabolity Dobór warunków rozdzielania CE Pierwszym etapem był dobór warunków rozdzielenia w roztworach wzorcowych. Metodą rozdzielania była elektroforeza micelarna z detekcją UV. Dodatek dodecylo-siarczanu sodu (SDS) do elektrolitu podstawowego pozwolił na wytworzenie fazy pseudostacjonarnej w kapilarze i zwiększenie rozdzielczości kwasów HVA i VMA, które w strefowej elektroforezie pozostawały częściowo lub całkowicie nierozdzielne, ze względu na podobną budowę. Parametry takie, jak napięcie, stężenie SDS, pH i stężenie buforu podstawowego poddane zostały optymalizacji w celu uzyskania jak najlepszej rozdzielczości. Pomiar w optymalnych warunkach: 20 mM bufor tetraboranowy o pH=9,2, 50 mM SDS i napięcie 20 kV trwał 7 minut. Rozdzielanie metabolitów katecholamin Warunki rozdzielania: Warunki rozdzielania: Elektrolit: Eluent: 20 mM bufor tetraboranowy pH = 9, ACN / 0,3% kwas mrówkowy 50 mM SDS metoda gradientowa Napięcie: 20 kV Kolumna C8 150 x 2,1 mm, 5 µm Kapilara L = 48 cm Obj. Nastrzyku 20 µl L.D. = 40 cm Przepływ 0,2 ml/min i.d. = 50 µm Detektor DAD 254 nm Detektor UV 200 nm Procedura przygotowania próbki naturalnej Do oznaczania analitów w próbkach naturalnych konieczne było wstępne oczyszczenie z interferencyjnych składników matrycy. Przeprowadzono ekstrakcję do fazy stałej, stosując kolumny Waters Oasis® HLB Extraction Cartrige z wypełnieniem niepolarnym. W celu sprawdzenia odzysków przeprowadzono badanie odzysku metodą dodatku wzorca. Oczyszczenie próbki: 1. Odwirowanie materiału białkowego 10 min obr./min 2. Filtrowanie 0,45 µm x rozcieńczenie SPE (Oasis): 1. 50 ml próbka 2. 5% MeOH wymycie matrycy 3. 2 ml MeOH wymycie analitów Zatężanie: 1. Odparowanie MeOH 2. Rozpuszczenie pozostałości w 200 µl H2O 3. Odwirowanie Oznaczanie kwasów w próbce moczu Po oczyszczeniu próbki moczu z zastosowaniem powyższej procedury wykonano oznaczenie kwasów HVA, VMA i 5HIAA metodami HPLC i CE Warunki rozdzielania CE Kapilara: Elektrolit podstawowy: L=48 cm mM bufor tetraboranowy L.D.=40 cm pH = 9,2 i.d.=50 µm mM SDS V = 20 kV Detekcja: UV (200 nm) Wyniki oznaczania kwasów HVA, VMA i 5-HIAA w próbce moczu Podsumowanie Opracowano warunki rozdzielania badanych kwasów metodami HPLC i CE z detekcją UV Określono wydajność procesu zatężania na stałym sorbencie (SPE) Opracowano procedurę przygotowania próbki Zoptymalizowano procedurę płukania kapilary pomiędzy pomiarami Oznaczono badane kwasy metodami HPLC i CE w próbce moczu metodą dodatku wzorca Wyznaczenie odzysków przy zatężaniu SPE 5-HIAA HVA VMA DOPAC Kolumna I 59 % 97 % 102 % 130 % Kolumna II 67 % 88 % 94 % 114 % Kolumna III 56 % 91 % 115 % Średnia 61 ± 0,2 % 92 ± 0,2 % 97,8 ± 0,1 % 116 ± 1 % Waters Oasis® HLB Extraction Cartrige Elektroforeza kapilarna HPLC Kwas wanilinomigdałowy (VMA) Kwas homowanilinomigdałowy (HVA) 5HIAA VMA DOPAC HVA Oznaczany analit CE [mg/L] HPLC Poziom stężeń analitów w moczu (literatura) [mg/L] 5HIAA 4,91 ± 0,29 3,18 ± 0,29 1,3 – 7,6 HVA 66,0 ± 5,4 16,7 ± 1,9 VMA 6,30 ± 0,33 27,8 ± 3,3 DOPAC - < 0,7 Kwas dihydroksyfenylooctowy (DOPAC) Kwas 5-hydroksyindolooctowy (5-HIAA) Czas retencji [min] Adrenalina (E) Kwas wanilinomigdałowy (VMA) 3,4dihydroksyfenyloglikol (DHPG) Kwas 3,4dihydroksymigdałowy (DHMA) 3-metoksy-4-hydroksyfenyloglikol (MHPG) Noradrenalina (NE) Dopamina (DA) Kwas homowanilinowy (HVA) 3,4-dimetoksyfenyloetyloamina (DIMPEA) 3-metoksy-4-hydroksyfenyloetanol (MOPET) Kwas dihydroksyfenylooctowy (DOPAC) Serotonina (5-HT) Kwas 5-5-hydroksyindooctowy (5-HIAA) 5-5-hydroksytryptofol (5-HTOL) Kwas 5-metoksyindooctowy (5-MIAA) Różnice w wynikach oznaczeń metodami HPLC i CE wynikają przypuszczalnie z obecności zakłóceń nieusuniętymi składnikami matrycy moczu i wymagają dalszych badań CE: Krótki czas analizy do 7 minut Wysoka sprawność Elektroforeza micelarna HPLC: - Czas analizy 15 minut - Prosta metoda pozwalająca rozdzielić główne metabolity katecholamin - Bardzo dobrze rozdzielone kwasy HVA i VMA, szczególnie podobne strukturalnie