Fluorescencja.

Prezentacja na temat: "Fluorescencja."— Zapis prezentacji:

1 Fluorescencja

2

3

4

5

6 Absorpcja / Emisja l A FEm P FEx Wzajemne relacje widm absorpcji, fluorescencji (em., eks.) i fosforescencji

7 s*s > s*n > p*p > p*n
H3C C=O H3C s* p* n p s s*s > s*n > p*p > p*n próżniowe duża intensywność mała intensywność

8 Niektóre elementy budulcowe białek (i w daleko mniejszym stopniu
kwasów nukleinowych) są naturalnymi fluoroforami, których fluorescencja bardzo silnie zależy od otoczenia – wg. opisanych mechanizmów (specyficzne i niespecyficzne efekty, wygaszanie)

9 Absorpcja Fluorescencja
Fluorescencja reszt aromatycznych aminokwasów w białkach Absorpcja Fluorescencja

10

11 Za to doskonałym fluoroforem jest reszta Trp
Położenie pasma emisji Trp ściśle zależy od środowiska wokół niego

12 Jeżeli środowisko to zmieni się np
Jeżeli środowisko to zmieni się np. na wskutek denaturacji – Trp z hydrofobowego wnętrza białka o niskiej er przeniesie się do wody o wysokiej er – będzie to miało swoje odbicie w widmach emisyjnych fluorescencji

13 Dimeryzacja mellityny – Trp jest na wewnetrznej ściance monomerów

14 Fluorescencja Trp jest bardzo wrażliwa na wygaszacze – zewnętrzne – np
Fluorescencja Trp jest bardzo wrażliwa na wygaszacze – zewnętrzne – np. I-, akrylamid, ale również te które są częścią białek: -SS-, naładowane lub polarne łańcuchy boczne, sąsiednie Trp. To sprawia, że o ile przesunięcie maksimum emisji Trp wywołane denaturacją globularnego białka w wodzie jest w zasadzie zawsze w kierunku dłuzszych fal, o tyle bardzo trudno jest wyrokować czy denaturacja doprowadzi do wzrostu czy spadku F (czy silniejsze są wewnetrzne wygaszacze sąsiedztwa Trp, czy woda?). Trp -SS- Trp

15 Zewnętrzne wygaszacze działają przewidywalnie

16

17 Spektrometria mas – pozwala zmierzyć m/z

18

19

20

21 Techniki jonizacji Jonizacja elektronami (Electron Ionisation – EI) – jonizacja przy pomocy wiązki elektronów. Elektrorozpylanie (Electrospray, ESI), polegające na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną substancję z igły, do której przyłożono wysokie napięcie (zwykle 1–5 kV) Jonizacja chemiczna (Chemical Ionisation, CI) – jony wytwarzane są na skutek zderzeń cząsteczek badanego związku chemicznego z jonami pierwotnymi obecnymi w źródle jonów. Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – MALDI) – w której stosuje się jonizację laserową, ale z tak dobraną energią wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do ich "wybijania" ze specjalnie przygotowanej matrycy. Plazma wzbudzona indukcyjnie (ICP) Bombardowanie jonami (spektrometria mas jonów wtórnych – Secondary Ion Mass Spectrometry – SIMS)

22 Analizator czasu przelotu
Analizatory masy Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF) Kwadrupol Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR)

23 Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS)
Al2   AlO   Si

24 lecytyna Na seryna Komórka z łożyska na podłożu Si