Transformacja plastydów Paul Maliga „Progress towards commercialization of plastid transformation technology” Justyna Sojka Przemek Łabuz

Genom plastydów - plastom 120 – 180 kpz (około 130 genów), 1000 – 50 000 (zboże) identycznych kopii we wszystkich typach plastydów, podobna budowa u wszystkich roślin: liczba kodowanych genów, sekwencje i wzajemne położenie, pojedyncza komórka nawet setki chloroplastów, zawierają 10 – 20 % całkowitego DNA komórki, cechy Eubakterii: geny zorganizowane w operony, prokariotyczny system ekspresji.

Pierwsza udana próba - 1988 Chlamydomonas reinhardii 60% objętości komórki - 1 wielki chloroplast, transformacja prawidłowym allelem genu atpB (prawidłowe funkcjonowanie syntazy ATP) – przywrócenie aktywności na drodze rekombinacji homologicznej. Pierwsza transformacja roślin wyższych 1989 - Nicotiana tabacum.

Tworzenie konstruktu genowego: Transkrypcja zależy od: promotora, typu plastydu, typu komórki, nie od lokalizacji na chromosomie!!! Mechanizmy uniknięcia ekspresji z DNA jądrowego: markery selekcyjne nie ekspresjonowane poza plastydami, unikanie promotorów dobrze funkcjonujących w jądrze, w plastydach mechanizmy konwersji w mRNA cytydyn do urydyn – zmiana kodonu START: ACG na funkcjonalny AUG, blokada ekspresji z genomu jądrowego.

Polimerazy RNA PEP – heteromeryczna polimeraza bakteryjna kodowana przez genom plastydowy i jądrowy, NEP - kodowana przez genom jądrowy i importowana post-translacyjnie, Faga T7 – ekspresja genom jądrowy, importowana do plastydów dzięki sekwencji skierowującej rbcS, możliwość indukcji chemicznej dzięki regulacji promotora jądrowego, specyficzna transkrypcja, system niezależny od PEP i NEP. - silny promotor sigma70 PEP – promotor z operonu rRNA (Prrn),

Optymalizacja kodonów Różnice pomiędzy używanymi kodonami plastydowymi i cytoplazmatycznymi: geny cytoplazmatyczne - bogate w GC, geny plastydowe - bogate w AT. Ekspresja niezmodyfikowanych sekwencji prokariotycznych: geny bogate w AT, podobna struktura mRNA do mRNA plastydowego. Dla sekwencji eukariotycznych optymalizacja kodonów niekonieczna (1,5 – 2 krotnie zwiększa ekspresję): jedyny problematyczny kodon to CGC, używany 3,9 razy na 1000 kodonów – wymagany poziom 4,3

Stabilność mRNA kaseta PL - promotor i region kontroli translacji, rola w inicjacji translacji, optymalizacja bardzo ważna, zawiera 5’UTR lub 5’ TCR (5’UTR i N - terminalny fragment regionu kodującego) oraz strukturę stem-loop - wpływ na stabilność mRNA, kaseta T - terminacja translacji, zawiera 3’ UTR i strukturę stem-loop.

Streptomycyna, spektomycyna Metody selekcji – oporność na antybiotyki Streptomycyna, spektomycyna gen aadA (najczęściej używany), ATP SPEKTYNOMYCYNA gen dla plastydowego 16 S rRNA (rrn16) z mutacją punktową, inhibitor translacji u Priokaryota, małe efekty uboczne dla komórek roślin, 16 S rRNA wielu roślin jednoliściennych naturalnie niewrażliwa na spektomycynę). AMP SPEKTYNOMYCYNA

Metody selekcji gen nptII fosfotransferaza neomycyny – kanamycyna, markery recesywne przywracające zdolność wzrostu fotoautotroficznego niefotosyntetyzującym mutantom, geny tolerancji na herbicydy (bar), FLARE-S (Fluorescence Antibiotic Resistance) – fuzja genów gfp i aadA, GUS i GFP.

Metody transformacji (oprócz ściany i błony komórkowej), dodatkowa podwójna błona plastydów (oprócz ściany i błony komórkowej), brak znanych wirusów infekujących chloroplasty, metoda biolistyczna (biological + balistic) (najbardziej wydajna, mechaniczne zniszczenia plazmidu, indukcja mutacji przez wolfram), glikol polietylenowy (PEG) w obecności DNA wektorowego – chloroplasty tuż pod błoną komórkową protoplastu, permeabilizacja potrójnej błony, mikroiniekcja (ekspresja przejściowa), transformacja izolowanych plastydów.

Podstawy transformacji LTR RTR Plastydowe „Dzikie ”DNA DNA stransformowane rekombinacja homologiczna (prokariotyczny system RecA): flankowanie genu fragmentami LTR i RTR – sekwencje homologiczne do wybranych rejonów ptDNA (1-2 kb), ok. 16 takich miejsc, konstrukt do 50 kb.

HOMOPLAZMIA Aby uzyskać stabilną ekspresje genu wszystkie kopie genomu plastydowego musza być transformowane Zmiana tylko w pojedynczych kopiach ptDNA

HOMOPLAZMIA Mozaika „dzikich” i stransformowanych ptDNA. Losowa segregacja ptDNA pomiędzy potomne plastydy i losowa segregacja plastydów pomiędzy dzielące się komórki.

Eliminacja markerów selekcyjnych CRE-loxP – miejscowo specyficzny system rekombinacyjny faga P1 Agrobacterium aadA Transgen lox lox rekombinaza CRE- wprowadzona do genomu jądrowego, skierowana do plastydu Utrata aktywności CRE drogą klasycznego krzyżowania u potomstwa.

Transformowane rośliny Chlamydomonas reinhardii, tytoń, rzepak, ziemniak (amyloplasty, chloroplasty), ryż (trudność regeneracji), Arabidopsis (przejściowa ekspresja). Chromoplasty - ekspresja organowo specyficzna, niewiele niższa niż w chloroplastach, lecz wykluczone ryzyko zaburzenia fotosyntezy marchewka - korzeń, pomidor - owoc.

Problemy niewielka ilość gatunków stransformowanych z sukcesem, brak rutynowych metod transformacji plastydów (tylko dla tytoniu), problem regeneracji roślin po transformacji, transformacja plastydów wymaga kultur in vitro (ekspozycja fragmentów tkanek na warunki selekcyjne), brak glikozylacji białek.

Zalety… eliminacja markerów selekcyjnych, dziedziczenie po linii żeńskiej w większości gatunków o znaczeniu uprawnym (wyjątek lucerna) – ochrona przed rozprzestrzenieniem się transgenu przez pyłek, szybkość (9 miesięcy od DNA do nasion do produkcji na masową skalę), bezpośrednia ekspresja bakteryjnych DNA i cDNA człowieka, integracja z genomem na zasadzie rekombinacji homologicznej, brak efektów pozycyjnych, wyciszania genów, wszystkie linie zwykle identyczne fenotypowo i genotypowo, możliwość ekspresji równocześnie wielu genów – wykorzystanie operonów (DNA policistronowe dobrze transkrybowane).

…zalety reakcje wymagające energii blisko miejsca jej produkcji w chloroplastach, bardzo wydajny system – ekspresja nawet do 40% TSP, większa stabilność białek (zamknięte, zdefiniowane środowisko – proteazy, jony, mniej szlaków degradacji w plastydach), tworzenie mostków disiarczkowych, dobre miejsce do lokalizacji toksycznych białek dla komórki roślinnej, wykorzystanie specyficznej indukcji genów przez światło w chloroplastach lub produkcji białek w zależności od typu plastydu.

Zastosowanie: badanie funkcji genów chloroplastowych, uzyskanie roślin wiążących azot, zwiększenie wydajności fotosyntezy – wiązanie CO2 przez RUBISCO, zwiększenie ilości lipidów w nasionach przez podniesienie aktywności karboksylazy AcCo-A, produkcja Hst – rekombinantowej, ludzkiej somatotropiny (7% TSP) lub szczepionek – toksyna z Clostridium tetani, produkcja insektycydów – cry.

Literatura: „Engineering the plastid genome of higher plants” – Paul Maliga „Genetic engineering of the chloroplast” – Peter B. Heifetz „Protein expresion in plastids” - Peter B. Heifetz, Ann Marie Tuttle „Transgenetic Plastids in Basic Research and Plant Biotechnology” – Ralph Bock „Engineering chloroplasts:an alternative site for foreign genes, proteins, reactions and products” – Lawrence Bogorad