NOWE METODY DIAGNOSTYKI GRUŹLICY III Konferencja Naukowo-Szkoleniowa „Zakażenia Układu Oddechowego” 20-22 października 2006 NOWE METODY DIAGNOSTYKI GRUŹLICY Hanna Grubek-Jaworska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie

Około 80% zachorowań na gruźlicę wykrywa się z objawów Jedynym, niepodważalnym potwierdzeniem wstępnego rozpoznania choroby jest uzyskanie dodatnich wyników diagnostyki mikrobiologicznej. W 2005 r. wśród nowo zarejestrowanych (9 280) jedynie u 5 409 potwierdzono gruźlicę bakteriologicznie (58,3 %), wśród chorych na gruźlicę płuc 61,2 %

Specyfika laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy wiąże się z: niskim tempem namnażania się prątków na pożywkach koniecznością stosowania wielu technik wykrywania zakażenia mikroskopia techniki hodowlane przyspieszające wzrost techniki molekularne

Prawidłowa laboratoryjna diagnostyka gruźlicy obejmuje bakterioskopię wyhodowanie prątków określenie gatunku wyhodowanych prątków określenie lekowrażliwości

Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki gruźlicy jest spełnienie powyższych wymogów diagnostycznych w maksymalnie krótkim czasie Docelowo całość diagnostyki nie powinna przekraczać 21- 25 dni

identyfikacja M.tuberculosis complex Laboratoria prątka gruźlicy I Rzędu: mikroskopia II Rzędu: hodowla identyfikacja M.tuberculosis complex ocena lekowrażliwości na INH,RMP,SM,EMB III Rzędu: identyfikacja ważniejszych gatunków prątków testy lekowrażliwości dla leków drugiej linii testy lekowrażliwości dla prątków atypowych

Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka gruźlicy bakterioskopia uzupełniona o metody molekularne wyhodowanie prątków pożywka L-J pożywki płynne z różnymi systemami detekcji określenie gatunku wyhodowanych prątków konwencjonalne metody bioch.-mikrobiologiczne metody molekularne analiza kwasów mikolowych techniką HPLC określenie lekowrażliwości metody fenotypowe metody molekularne?

Mycobacterium sp. barwienie metodą Ziehl-Neelsena mikroskopia w świetle widzialnym barwienie auraminą mikroskopia w świetle UV

obecność prątków wynik     O 1-2 / 300 pól widzenia 1-9 / 100 pól widzenia 1-9 / 10 pól widzenia 1-9 / 1 pole widzenia > 9 / 1 pole widzenia Prawdopodobnie negatywny (nie wystarczająca liczba prątków dla wykrycia w bekterioskopii) Nie uznawany za pozytywny, konieczność badania dalszych próbek + (sporadyczne) ++ (nieliczne) +++ (średnio liczna) ++++ (liczne) obecność prątków wynik */ przy powiększeniu 800 x - 1000x   (

B a k t e r i o s k o p i a (+) (-) (+) (-) Wykrywa chorych silnie prątkujących Czas wykonania około 3 godzin Niska cena badania Nie różnicuje prątków żywych i martwych Nie różnicuje gatunku prątków Czułość w wykrywaniu gruźlicy w plwocinie około 30 %

AFB (+) M.Tuberculosis 30 - 40% NTM (MOTT) 60 – 70%

Chorzy - mikroskopia dodatnia (n = 217) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii (1999-2005) mykobakteriozy n = 9 (7%) TB n = 82 (38%) NTM n = 135 (62%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 126 (93%) potwierdenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MTB

Przy wynikach AFB(+) zalecanym postępowaniem jest wykonanie (możliwie z tej samej próbki klinicznej) badania techniką molekularną, która pozwala zidentyfikować genom prątków gruźlicy

Systemy molekularne dopuszczone do rutynowej diagnostyki gruźlicy Amplicor (MTB) test (Roche Molecular System,Somerville, New Jersey) rozpoznaje M.tuberculosis complex PCR (6 – 8 godz) Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen-Probe Inc. San Diego, Ca) rozpoznaje M.tuberculosis complex, M.avium complex, M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.gordonae, rRNA (2 – 3 godz) BDProbe Tec ET Mycobacterium tuberculosis complex Direct Detection Assay (SDA - Strand Displacement Amplification) (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.) rozpoznaje M.tuberculosis complex, M.avium complex oraz M.kansasii SDA (1,5 godz)

Metody biologii molekularnej (+) (-) Czas wykonania badania – kilka / kilkanaście godzin Czułość wykrywania gruźlicy około 70 - 90 % Swoistość 97-100 % Wykrywanie zakażeń w bardzo wczesnej fazie Stosunkowo wysoka cena badania Szkolenie, aparatura Możliwość identyfikacji jedynie 5 gatunków prątków: M.tbc complex, M.avium, M.intracellulare, M.konsasii, M.gordonae Jedynie metodą molekularną można w czasie kilku godzin wykryć obecność prątków gruźlicy bezpośrednio w materiale klinicznym

Wykrycie produktów reakcji Amplicor MTB PCR (Roche) Próbka kliniczna Dekontaminacja Zagęszczanie Izolacja DNA PCR Wykrycie produktów reakcji 103 - 10 4 101 - 10 2

W zakresie diagnostyki gruźlicy, czułość i W zakresie diagnostyki gruźlicy, czułość i swoistość wymienionycvh systemów molekularnych jest porównywalna W rutynowej diagnostyce gruźlicy nie należy stosować metod ”domowych” Próbki kliniczne mogą być przesyłane pocztą (do 5 dni) bez utraty wartości diagnostycznej w zakresie zakażeń prątkowych

badanie następnych próbek REKOMENDACJA CDC próbka mikroskopowo dodatnia In symtomatic TB suspected patients CDC recommends next ways amplifikacja pozytywna 1x amplifikacja negatywna 2 x inhibicja obecna brak TB badanie następnych próbek mykobakterioza ?

próbka mikroskopowo ujemna REKOMENDACJA CDC próbka mikroskopowo ujemna CDC recommendation for sympthomatic TB suspected microscopically negative patients amplifikacja negatywna 2 x amplifikacja pozytywna 2 x amplifikacja zahamowana ? nie TB TB

Chorzy na gruźlicę (1999-2005) metoda i wynik liczba chorych Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie (1999-2005) Chorzy na gruźlicę (1999-2005) metoda i wynik liczba chorych AFB (+) hodowla (+) 62 AFB (-) hodowla (+) 51 AFB (+) hodowla (-) 20 * AFB (-) hodowla (-) 9 * ogółem 142 w próbkach 9 / 51 chorych wynik testu MTD był ujemny czułość mikroskopii 58% czułość hodowli 79% * dodatni test molekularny (MTB)

Systemy detekcji wzrostu prątków na pożywkach płynnych radiometryczny Bactec 460 Tb (Becton Dickinson) (możliwość różnicowania M.Tbc / NTM) kolorymetryczny system - MB Bac T (Organon Teknika Corporation) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze, osobne podłoża dla próbek krwawych) system fluorymetryczny MGIT (Mycobacterial Growth Indicatory Tube) (Beckton Dickinson) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze)

wyhodowane prątki M.Tuberculosis 30 - 40% NTM (MOTT) 60 – 70%

Chorzy – hodowle dodatnie (n = 312) (1999-2005) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii) Chorzy – hodowle dodatnie (n = 312) mykobakteriozy n = 22 (11%) TB n = 113 (36%) NTM n = 199 (64%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 170 (89%) M.xenopi n = 57 M.kansasii n = 42 M.gordonae n = 33 M.avium n =10 M.abscseus n = 9 M.fortuitum n = 8 M.flavescens n = 1 M.scrofulaceum n = 1 M.neoaurum n = 1 M.nonchromogenicum n = 1 unidentified sp. n = 9 potwierdzenie TB testem MTB lub techniką HPLC wykluczenie TB testem MTB, typowanie gatunku HPLC

HPLC (high pressure liquid chromatography)   HPLC (high pressure liquid chromatography) Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa Analiza składu kwasów mykolowych: Hydroliza Ekstrakcja chloroformem Przekształcenie kwasów mykolowych w bromofenacylowe pochodne Rozdział na kolumnie w fazie odwróconej Wzór elucyjny badanej próby Analiza porównawcza z biblioteką zgromadzonych wzorów elucyjnych szczepów wzoprcowych z ATCC M.tuberculosis LMW HMW M.avium LMW HMW M.interjectum LMW HMW

czułość czasochłonność Porównanie czułości i czasochłonności metod laboratoryjnych w wykrywaniu gruźlicy czułość czasochłonność (%) metody molekularne 70 – 90 1 dzień hodowla 70 kilka dni - 8 tyg mikroskopia 33 – 50 3 - 4 godz

bk - próbka kliniczna (po wstępnym opracowaniu) metoda molekularna bakterioskopia hodowla wynik bk - Tbc nie Tbc bk+ 24 h ujemna dodatnia test niacynowy lub metody molekularne MAC M.kansasii M.tuberculosis HPLC wynik kilkadziesiąt gatunków prątków M.tuberculosis kilkanaście dni do 10 tyg. wynik lekooporność met. hodowlane lub met. molekularne kilka godzin do 40 dni

Ujemne wyniki badań laboratoryjnych nie wykluczają rozwoju choroby bowiem żadna z metod laboratoryjnych nie charakteryzuje się 100% czułością

Najczęstsze błędy laboratoryjne i interpretacyjne lub zaniechania w mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy

I Jednoznaczna interpretacja mikroskopii AFB (+) jako gruźlicy, AFB (+) może wskazywać gruźlicę saprofit środowiskowy – (NTM / MOTT) mykobakterioza w przypadku materiałów bronchoskopowych zanieczyszczenie instrumentarium

II Brak typowania do gatunku wyrośniętych szczepów prątków - poprzestanie na wykonaniu testu niacynowego różnicujacego jedynie M.tbc oraz MOTT nie pozwala to na: diagnozowanie mykobakterioz wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń prątkami środowiskowymi

III Zaniechanie wzywania na dodatkowe badania mikrobiologiczne chorych ze wskazaniami klinicznymi, u których wyhodowano prątki niegruźlicze Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy

IV    Brak systematycznej oceny mikrobiologicznej czystości sprzętu endoskopowego

Immunologiczna diagnostyka zakażenia M Immunologiczna diagnostyka zakażenia M.tuberculosis w warunkach in vitro Diagnostyka uśpionych zakażeń M.tbc Latent Tuberculosis Infection - LTBI

Odpowiedź na zakażenie M.tuberculosis cell mediated immunity nasilenie odpowiedzi przeciwciała replikacja prątków L a t e n t TB I n f e c t i o n czas choroba zakażenie

skórny test tuberkulinowy Zjawisko, które było podstawą współcześnie stosowanego testu tuberkulinowego opisał w 1890 roku Robert Koch, kontynuatorami jego pracy byli Charles Mantoux i Clemens von Pirquet skórny test tuberkulinowy (tuberculin skin test -TST) stosowany jest od 1907 roku.

pomiar testu tuberkulinowego test skórny pomiar testu tuberkulinowego IFN-γ stymulacja IL- 8 TNF- komórka pamięci komórka prezentująca antygen IFN-γ TNF- IL- 8 krew - test in vitro pomiar produkcji IFN-γ

Czynniki negatywizujące TST: Zależne od osoby badanej infekcje (wirusowe, bakteryjne, grzybicze) zaburzenia metaboliczne niedożywienie choroby narządów limfatycznych(np..białaczka, sarkoidoza) leki (glikokortykoidy, leki immunosupresyjne) wiek Zależne od preparatu tuberkulinowego nieodpowieednie rozcieńczenie chemiczna denaturacja adsorpcja na szkle kontaminacja Zła technika szczepienia Zła technika odczytu

ekspozycja na M.tbc gruźlica 5 -10 % brak dowodów zakażenia 5 % zakażenie 95 % zakażanie uśpione 95 % gruźlica 5 -10 % nie dochodzi do rozwoju choroby 90% wg E.Tortoli 2005

Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat stworzyły test alternatywny dla skórnego testu tuberkulinowego Jest to test in vitro nowej generacji mierzący poziom odporności komórkowej Podstawą testu jest oddziaływanie na komórki w warunkach in vitro wysoko swoistych dla M.tuberculosis antygenów ESAT-6 oraz CP-10 stymulujących wydzielanie IFN-gamma

ESAT-6 - early secretory antigenic target 6 CP-10 - culture filtrate protein niskocząsteczkowe białka swoiste dla M.tuberculosis Antygen NTM Antygen ESAT-6 CFP-10 ESAT-6 CFP-10 M abscessus - - M avium - - M branderi - - M celatum - - M chelonae - - M tuberculosis +   + M fortuitum - - M gordonae - - BCG M intracellulare - - moreau - - M kansasii + + pasteur - - M malmoense - - M marinum + + tokyo - - M genavense - - danish - - M scrofulaceum - - glaxo - - M smegmatis - - montreal - - M szulgai + + M terrae - - - M vaccae - - M xenopi - -

QuantiFERON-TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S. Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (Latent Tuberculosis Infection -LTBI) CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)

Quantiferon metoda probówkowa 1 krew inkubacja 16 - 24h w 37°C kontrola ESAT6 + CFP10 mitogen ujemna wirowanie kolor 2 DO 450nm badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny IFN-g IU/ml odczytanie stężenia z krzywej standardowej

I etap – inkubacja leukocytów z antygenem, zebranie nadsączu krew + antygen kontrole: krew bez Ag krew + mitogen Inkubacja w 37 16-24 godz. wirowanie,2000g przez 5-10 min pobranie 200 μl plazmy ELISA – IFN-γ płukanie, dodanie substratu dodanie roztworu stopującego konjugat + badana plazma lub standard odczytanie stężenia z krzywej standard. inkubacja 120 min

Quantiferon – metoda płytkowa ESAT-6 CFP-10 mitogen pobranie krwi krew + antygeny inkubacja 24h , wydzielenie IFN-γ KOLOR DO 450nm IFN-g IU/ml ‘sandwich’ ELISA, (incubacja 120 min) dodanie substratu, reakcja barwna odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej

QuantiFERONTB Gold – interpretacja wyników miogen – K ESAT 6 – K i / lub CFP 10 – K wynik interpretacja  0,5  0,35 pozytywny zakażenie prawdopodobne < 0,5 < 0,35 negatywny nieprawdopodobne nieokreślony brak wyniku IU IFN- γ /ml

T SPOT- TB assay metoda ocena liczby komórek syntetyzujących IFN-γ kontrola ESAT-6 CFP-10 mitogen pobranie krwi separacja leukocytów jednojądrzastych inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ kOLOR ‘sandwich’ ELISA, (Inkubacja 120 min) inkubacja 24 h w 37oC ocena liczby barwnych plamek

T SPOT- TB assay 1 Zawiesinę leukocytów krwi (250 000/ml) nawarstwia się na płytkę opłaszczoną przeciwciałem anty IFN-γ, dodaje antygeny swoiste dla TB  uwalniany IFN-γ wychwytywany jest przez przeciwciała 2 Po odpłukaniu dodaje się wtórne przeciwciało znakowane enzymem, a nstępnie substrat, co wizualizuje test  plamki barwne (1 plamka = 1 komórka T)

Jeżeli w kontroli negatywnej.>10 lub kontroli pozytywnej <20 test nie może być interpretowany

Korelacja IFN-γ / Mantoux czułość 89.0% (105/118) 65.7% (50/76; 5 mm) swoistość 98.2% (213/217) 35.4% (73/113; 10 mm) Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004

FIG. 1. Individual IFN- response to PPD and either of the RD1 antigens ESAT-6 or CFP-10 (E6/C10) (for each patient the highest IFN- responses) are shown. In the left panel, the responses of the TB suspect population (n = 73); and in the right panel, the responses for the healthy control population (n = 39). The cutoff value for a positive response was set at 0.35 IU/ml for ESAT-6 and CFP-10 and arbitrarily at 1.5 IU/ml for PPD. The dotted lines represent the cutoff for the specific antigens and PPD. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, April 2005, p. 491-496, Vol. 12, No. 4

T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp. 59-64, (2004) cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp. 59-64, (2004) Figure 1. Dot plot of individual responses to CFP-10 and ESAT-6 for 118 culture-positive patients with tuberculosis (TB) (a), 213 subjects with a low risk for TB exposure (b), and 33 TB suspects whose TB status could not be determined, as Mycobacterium tuberculosis could not be cultured (c). *For "ESAT/CFP" the data for the antigen (ESAT-6 or CFP-10) giving the highest response is shown. The dashed line represents the cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ

Ograniczenia metodyczne Quantiferonu- TB Gold (błędy techniczne) użycie innych antykoagulantów niż heparyna nieodpowiedni transport krwi zbyt wysoke stężenie IFN-gamma we krwi czas > 12 godzin po pobrania krwi

Ograniczenia merytoryczne Quantiferonu- TB Gold test nie powinien być stosowany w przypadkach zaniżonej liczby limfocytów w przypadkach upośledzonej reaktywności immunologicznej (HIV, AIDS, transplantacje, immunosupresja polekowa) u kobiet w ciąży u osób poniżej 17 r.ż.

kierunki badań: QFT-G u dzieci, szczególnie <5 r.ż. QFT-G u osób z zaburzeniami układu odpornościowego czułość testuw gruźlicy pozapłucnej przypadki TB w następstwie wykluczenia lub potwierdzenia LTBI przez QFT-G czas po ekspozycji na M.tbc niezbędny dla pozytywizacji QFT-G analiza ekonomiczna stosowania TST vs QFT-G zmiany QFT-G u chorych leczonych z powodu LTBI oraz TB – monitorowanie terapii

W diagnostyce rutynowej wiele spośród wspomnianych nowszych technik mogą stosować jedynie wybrane laboratoria Techniki te stanowią w wielu przypadkach jedynie uzupełnienie metod konwencjonalnych Zaleca się łączenie nowych technik z diagnostyką tradycyjną

dziękuję za uwagę