http://biolmolgen.slam.katowice.pl WYKŁAD 2 cz. 4

NAPRAWA LUB APOPTOZA CYKLINA Cdk CYKLINA : Cdk ATP pRB : E2F ADP FAZA G1 FAZA S FAZA G1 FAZA S NAPRAWA LUB APOPTOZA

NAPRAWA LUB APOPTOZA MDM4 p53 Uszkodzenie BŁĄD MDM2 Stabilizacja p53 p21WAF1/CIP CYKLINA Cdk CYKLINA : Cdk ATP pRB : E2F ADP pRB : E2F ppRB E2F FAZA G1 FAZA S FAZA G1 FAZA S NAPRAWA LUB APOPTOZA

Gdy brak aktywności p53 NAPRAWA LUB APOPTOZA CYKLINA : Cdk pRB : E2F ppRB E2F ATP ADP FAZA G1 FAZA S CYKLINA Cdk NAPRAWA LUB APOPTOZA

KLASYFIKACJA RDZENIAKÓW MÓŻDŻKU Klasyczny Neuroblastyczny Desmoplastyczny Kryńska B., et al. (1999) PNAS, 96:11519-24

IMMUNOHISTOCHEMICNE WYKRYWANIE ANTYGENU T VIRUSA JCV (JCV T-Ag) W RDZENIAKACH MÓŻDŻKU Powiększenie x400 (A & B); x200 (C); x1000 (wstawki) Groty wskazują komórki dzielące się Strzałki wskazują komórki z JCV T-Ag Kryńska B., et al. (1999) PNAS, 96:11519-24

IMMUNOHISTOCHEMICZNA ANALZA MARKERÓW RDZENIAKA MÓŻDŻKU Powiększenia x200 (D) & x400 (E i F). Synaptofizyna b tubulina klasa III GFAP Kryńska B., et al. (1999) PNAS, 96:11519-24

GENOM WIRUSA JCV Kryńska B., et al. (1999) PNAS, 96:11519-24 JCV 0.6 PCR primers Amplified DNA Probe JCV 0.6 0.7 0.8 0.9 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 (Mad-1) 5130 bp Region kontroli 5130/0 4495 277 492 526 883 1560 Agno VP3 VP2 t GENOM WIRUSA JCV 173 bp (4303-4327) (4255-4274) (4408-4427) 4771 4426 5013 2603 T 1469 2533 VP1 (2039-2019) (1848-1828) (1891-1872) 212 bp (2797-2776) (2600-2578) (2668-2663) 220 bp Kryńska B., et al. (1999) PNAS, 96:11519-24

WYKRYWANIE METODĄ PCR DNA JCV W RDZENIAKACH MÓŻDŻKU Kryńska B., et al. (1999) PNAS, 96:11519-24 Obszar kodujący wczesne geny (N-koniec antygenu T) Obszar kodujący wczesne geny, (C-koniec antygenu T) Obszar kodujący późne geny (białko kapsydu VP1)

KOMPLEKSY ANTYGENU T & p53 Kryńska B., et al. (1997) JCB, 67:223-30

EKSPRESJA p21 W OBECNOŚCI ANTYGENU T Kryńska B., et al. (1997) JCB, 67:223-30

EKSPRESJA CYKLIN E, A, & KINAZY CDK2 W OBECNOŚCI ANTYGENU T Kryńska B., et al. (1997) JCB, 67:223-30

EKSPRESJA CYKLINY D ORAZ KINAZ CDK4, & CDK6 W OBECNOŚCI ANTYGENU T Kryńska B., et al. (1997) JCB, 67:223-30

BLOKOWANIE APOPTOZY PRZEZ p300 WYMAGA OBECNOŚCI CYKLINY D1

KOMPLEKSY ANTYGENU T & pRB Kryńska B., et al. (1997) JCB, 67:223-30

EKSPRESJA E2F & PCNA W OBECNOŚCI ANTYGENU T PCNA – Proliferation Cells Nuclear Antigen – Antygen Proliferujących Komórrek Kryńska B., et al. (1997) JCB, 67:223-30

GENOM SV40 Rizzo P., et al. (2001) Cancer Biol, 21:63-71

ANTYGENY T U OKOŁO 22% PRZYPADKÓW SV40 & JCV WYKRYTO Kryńska B., et al. (1999) PNAS, 96:11519-24 PCR Immuno cyto SV40 JCV Wiek chemia T-Ag T-Ag T-Ag No. Płeć lata Diagnoza T-Ag (C-koniec) (N-term) (C-term) VP-1 1 M 5 Classic N/A - + - + 2 M 7 Desmoplastic N/A + + + + 3 M 6 Desmoplastic N/A - + - + 4 M 4 Classic N/A - + + + 5 M 5 Desmoplastic N/A - + - + 6 F 11 Classic N/A + + - + 7 M 2 Neuroblastic N/A - + + + 8 M 1.5 Desmoplastic - - + - + 9 F 4 Desmoplastic - - + + + 10 M 15 Desmoplastic + + + - - 11 F 42 Desmoplastic - - + - - 12 M 7 Classic - - + + + 13 F 18 Neuroblastic - - + - + 14 F 8 Desmoplastic - - + - + 15 M 7 Classic + - + + + 16 M 9 Classic - + + + + 17 F 3 Desmoplastic + - + + + 18 F 9 Desmoplastic - - - + + 19 M 5 Neuroblastic + - + + + 20 F 2 Classic - - - + + 21 M Newborn Classic - - + + + 22 M 12 Classic - + - - - 23 M 5 Neuroblastic - - + + + ANTYGENY T U OKOŁO 22% PRZYPADKÓW SV40 & JCV WYKRYTO

Tabela 2. Wykrywanie DNA SV40 w guzach u ludzi metodą PCR Rodzaj guza Publikacja Zestaw starterów Pozytywny % (wielkość produktu p.z.) wynik Pleural Griffiths et al.36 SV.for3/SV.rev (105) 26/26 100 mesothelioma SV.for2/SV.rev (574) 3/26 12 De Luca et al.27 SV.for3/SV.rev (105) 30/35 86 Pass et al.30 SV.for3/SV.rev (105) 30/42 71 Mayall et al.41 SV.for3/SV.rev (105) 5/7 71 Shivapurkar et al.44 SV.for3/SV.rev (105) 61/93 66 Carbone et al.16 SV.for3/SV.rev (105) 29/48 60 PYV.for/PYV.rev (172) 36/48 75 Procopio et al.54 PYV.for/PYV.rev (172) 50/83 60 Ramael et al.103 PYV.for/PYV.rev (172) 14/25 56 SV.for2/SV.rev (574) Cristaudo et al.48 RA3/RA4 (482) 10/18 56 Galateau-Salle PYV.for/PYV.rev (172) 10/21 48 et al.33

(wielkość produktu p.z.) wynik Tabela 2. Wykrywanie DNA SV40 w guzach u ludzi metodą PCR (c.d. 1) Rodzaj guza Publikacja Zestaw starterów Pozytywny % (wielkość produktu p.z.) wynik Pleural Dhaene et al.40 SV.for3/SV.rev (105) 13/28 46 mesothelioma Pepper et al.18 SV.for3/SV.rev (105) 4/9 44 PYV.for/SV.rev (172) 6/9 67 Strizzi et al.47 PYV.for/PYV.rev (172) 9/23 39 Mutti et al.100 SV.for3/SV.rev (105) 8/25 32 Strickler and SV.for3/SV.rev (105) 0/50 0 Goedert 23 Mulaterro et al.63 PYV.for/SV.rev (172) 0/12 0 Hirvonen et al.37 SV2for/SV.rev (576) 0/49 0 Emri et al.51 SV.for2/SV.rev (574) 0/29 0

(wielkość produktu p.z.) wynik Tabela 2. Wykrywanie DNA SV40 w guzach u ludzi metodą PCR (c.d. 2) Rodzaj guza Publikacja Zestaw starterów Pozytywny % (wielkość produktu p.z.) wynik Peritoneal Shivapurkar et al.44 SV.for3/SV.rev (105) 6/11 55 mesotheliomas Brochopulmonary Galateau-Salle PYV.for/PYV.rev (172) 18/63 29 carcinomas et al.33 Shivapurkar et al.44 SV.for3/SV.rev (105) 0/20 0 Procopio et al.34 PYV.for/SV.rev (172) 0/18 0 Carbone et al.16 SV.for3/SV.rev (105) 0/13 0 Pepper et al.18 SV.for3/SV.rev (105) 0/9 0 SV.for3/SV.rev (105) Choroid plexus Martini et al.20 PYV.for/PYV.rev (172) 5/6 83 tumours Bergsagel et al.14 SV.for3/SV.rev (105) 10/20 50 Huang et al.39 SVTAGP1/SVTAGP3 (158) 6/16 38 Lednicky et al.106 LA1/LA2 (294) 10/13 77 Bergsagel et al.14 SV.for3/SV.rev (105) 10/20 50 Ependymomas Bergsagel et al.14 SV.for3/SV.rev (105) 10/11 91 Lednicky et al.106 LA1/LA2 (294) 3/3 100 Martini et al.20 PYV.for/PYV.rev (172) 8/11 73

Tabela 2. Wykrywanie DNA SV40 w guzach u ludzi metodą PCR (c.d. 3) Rodzaj guza Publikacja Zestaw starterów Pozytywny % (wielkość produktu p.z.) wynik Ependymomas Weggen et al.53 SV.for3/SV.rev (105) 1/25 4 Bersagel et al.14 SV.for3/SV.rev (105) 7/11 64 Medulloblastomas Lednicky et al.106 LA1/LA2 (294) 2/6 33 Huang et al.39 SVTAGP1/SVTAGP3 (158) 5/17 29 Weggen et al.53 SV.for3/SV.rev (105) 2/116 2 Krynska et al.102 SV.for3/SV.rev (105) 5/23 22 Astrocytomas Martini et al.20 PYV.for/PYV.rev (172) 8/17 17 Huang et al.39 SVTAGP1/SVTAGP3 (158) 22/50 44 Meningiomas Martini et al.20 PYV.for/PYV.rev (172) 1/7 14 Weggen et al.53 SV.for3/SV.rev (105) 1/131 1 Oligodendroglioma Huang et al.39 SVTAGP1/SVTAGP3 (158) 3/12 25 Martini et al.20 PYV.for/PYV.rev (172) 0/9 0 Glioblastomas Martini et al.52 PYV.for/PYV.rev (172) 10/30 33

Tabela 2. Wykrywanie DNA SV40 w guzach u ludzi metodą PCR (c.d. 4) Rodzaj guza Publikacja Zestaw starterów Pozytywny % (wielkość produktu p.z.) wynik Osteosarcomas Lednicky et al.15 SV.for3/SV.rev (105) 5/10 50 TA1/TA2 (441) 5/10 50 Yamamoto et al.50 R1/R2 (315) 21/54 39 Carbone et al.17 SV.for2/SV.rev (574) 40/126 32 Mendoza et al.32 SV.for3/SV.rev (105) 9/35 26 Other bone Carbone et al.17 SV.for2/SV.rev (574) 14/34 32 Tumours Gamberi et al.46 PYV.for/SV.rev (172) 30/107 28 SV.for2/SV.rev (574) Papillary thyroid Pacini et al.31 SV.for3/SV.rev (105) 3/69 4 carcinomas (PTC) LA1/LA2 (294) Non-PTC thyroid Pacini et al.31 SV.for3/SV.rev (105) 0/9 0 tumours LA1/LA2 (294) Non-Hodgkin’s Rizzo et al.38 V5/SV6 (172) 3/29 10 lymphomas Martini et al.52 PYV.for/PYV.rev (172) 13/95 14

Tabela 2. Wykrywanie DNA SV40 w guzach u ludzi metodą PCR (c.d. 5) Rodzaj guza Publikacja Zestaw starterów Pozytywny % (wielkość produktu p.z.) wynik Hodgkin’s Martini et al.52 PYV.for/PYV.rev(172) 8/55 15 lymphomas AIDS lymphoma Rizzo et al.38 SV5/SV6 (172) 2/5 40 Prostatic tumours Radu et al.68 SV.for3/SV.rev (105) 4/33 12

2948–2953, PNAS, March 5, 2002, vol. 99, no. 5 Annemieke de Vries* †‡ , Elsa R. Flores*, Barbara Miranda* † , Harn-Mei Hsieh*, Conny Th. M. van Oostrom ‡ , Julien Sage*, and Tyler Jacks* † Howard Hughes Medical Institute, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA and ‡ National Institute of Public Health, Laboratory of Health Effects Research, 3720 BA Bilthoven, The Netherlands Targeted point mutations of p53 lead to dominant-negative inhibition of wild-type p53 function Celowana mutacja punktowa w genie p53 powoduje Dominujące-ujemne hamowanie funkcji dzikiego allelu p53

MUTACJA POJEDYNCZEO ALLELU p53 Rekombinacja homologiczna Mutacja de Vries A. et al. (2002) PNAS, 99:2948-53.

Udział mutacji jednego allelu p53 na przeżywalność komórek zarodkowych Obydwa nie aktywne allele p53 HETEROZYGOTYCZNA MUTACJA p53 JEDEN ALLEL p53 NIENAKTYWNY NORMALNY/ DZIKI GEN p53 de Vries A. et al. (2002) PNAS, 99:2948-53.

Udział mutacji jednego allelu p53 na przeżywalność komórek grasicy Apotoza zalezna odp53 Apoptoza nie zalezna odp53 (2002) PNAS, 99:2948-53. de Vries A. et al.

1–5, Nature Genetics, FEBRUARY 11, 2002, online publication Ronit I. Yarden1, Sherly Prado-Reoyo1, Magda Sgagias2, Kenneth H. Cowan2 & Lowrence C. Brody1 1 Genome Technology Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD 2 Eppley Institute of Cancer Research, University of Nebraska Medical Center, NA BRCA1 regulates the G2/M checkpoint by activating Chk1 kinase upon DNA damage BRCA1 reguluje punkt kontrolny cyklu komórkowego G2/M aktywując kinazę Chk1 w przypadku uszkodzenia DNA

(ataxia telangiectasia mutated/ATM and Rad3-related) Uszkodzenie DNA ATM/ATR (ataxia telangiectasia mutated/ATM and Rad3-related) ATM, ATR i hCds1/Chk2 to białka odpowiedzi na uszkodzenie DNA zmieniające fosforylację BRCA ? hCds1/Chk2 BRCA1 Chk1 –Kinaza regulatorowa Wee1 Kinaza Cdc25C Cdc2/cyklina B ARESZT w G2 M

BRCA1 G2 M Uszkodzenie DNA ATM/ATR Chk1 – Kinaza regulatorowa hCds1/Chk2 ? Cdc25C Wee1 Kinaza Cdc2/cyklina B G2 M ATM, ATR i hCds1/Chk2 to białka odpowiedzi na uszkodzenie DNA zmieniające fosforylację BRCA BRAK AKTYWNOŚCI BRCA1 NIEKONTROLOWANA PROLIFERACJA

UTRATA KONTROLI SPOŁECZNEJ Postępująca kumulacja TRANSFORMACJA NOWOTWOROWA Normalny nabłonek Przednowotworowe UTRATA KONTROLI SPOŁECZNEJ (APOPTOZA) Niekontrolowane podziały Postępująca kumulacja uszkodzeń genów Wczesne zmiany Późne zmiany NOWOTWÓR Nowotwór In Situ Postać złośliwa (Inwazyjna) Metastaza

K O N I E C DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ NASTĘPNY WYKŁAD NA TEMAT NOWE TECHNOLOGIE BIOLOGII MOLEKULARNEJ W DIAGNOSTYCE MEDYCZNEJ