Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów

Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmów Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu - określenie przynależności badanego organizmu do odpowiedniej jednostki taksonomicznej, najczęściej gatunku Gatunek - populacja mikroorganizmów wykazujących wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się od innych gatunków tego samego rodzaju

Identyfikacja taksonomiczna bakterii Szczep – grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki Szczep referencyjny – izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec) Gatunek – wiele szczepów podobnych w ściśle określonym zakresie cech Gatunek – grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujących co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA

Identyfikacja taksonomiczna bakterii Gatunek – grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe nG + nC % G+C = x 100% nA + nT + nC + nG W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10%

Cechy umożliwiające identyfikację bakterii morfologia skład chemiczny ściany komórkowej obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych zdolność do tworzenia pigmentów sposób odżywiania wymagania pokarmowe źródła C, N, S skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji wymagania tlenowe zakres temperatur i pH wzrostu wrażliwość na antybiotyki patogenność zależności symbiotyczne z innymi organizmami środowisko występowania obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna) sekwencja DNA genomowego

Metody identyfikacji mikroorganizmów Podział metod identyfikacji mikroorganizmów: a) biochemiczne b) biofizyczne c) biologii molekularnej d) immunochemiczne

Metody biochemiczne Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji lub rozkładu określonych związków chemicznych cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo wzrost lub jego brak zmiana zabarwienia pożywki reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem wytworzenie gazu

Testy biochemiczne Zawieszenie Naniesienie INKUBACJA (18 – 48 h) Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)

Metody biofizyczne Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznaczanie produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład struktur komórkowych Techniki elektroforetyczne Techniki oparte na chromatografii gazowej

Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych Analiza profili białkowych skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek komórkowych Sposób postępowania: izolacja białek komórkowych rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym barwienie rozdzielonych białek porównanie z profilami białkowymi bazy danych Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych Elektroforeza dwukierunkowa

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową Analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ściany komórkowej skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla każdego gatunku mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli zarówno ilościowy, jak i jakościowy skład ściany komórkowej bakterii kodowany jest przez DNA genomowe i nie ma na niego wpływu informacja genetyczna zawarta w plazmidach Analiza jakościowa – obecność specyficznych kwasów tłuszczowych Analiza ilościowa – określenie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową Sposób postępowania: saponifikacja i uwolnienie kwasów tłuszczowych metylowanie ekstrakcja z fazy wodnej rozdział z zastosowaniem chromatografii gazowej analiza wyników i porównanie z bazą danych Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o chromatografię gazową Microbial Identification System HP 5898 A firmy Hewlett Packard

Metody biologii molekularnej Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów kwasów nukleinowych Metody hybrydyzacyjne Metody oparte o technikę PCR

Metody hybrydyzacyjne Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych sondy są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA, zawierające sekwencje unikalne dla danego organizmu kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest znakowany radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H] barwnikiem fluorescencyjnym enzymem

Metody hybrydyzacyjne Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystują sondy DNA komplementarne do charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA) Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, gdyż występuje on w komórce bakteryjnej w dużej liczbie kopii (od 1 000 do 10 000) Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępność informacji odnośnie sekwencji rRNA pochodzących od różnych, często bardzo blisko genetycznie spokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej specyficzności

Metody hybrydyzacyjne Dot blot

Metody hybrydyzacyjne Southern blotting

Metody hybrydyzacyjne homologia kwasów nukleinowych powyżej 60% świadczy o przynależności organizmu do określonego gatunku stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego drobnoustroju z danym rodzajem hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić między DNA lub RNA organizmów niespokrewnionych

FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem

FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ Wynik FISH dla mieszaniny wybranych bakterii z rodzaju Bacillus, Escherichia, Pseudomanas, Shigella

Metody wykorzystujące technikę PCR Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) - enzymatyczna amplifikacja (zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów gen kodujący 16S rRNA mikroorganizmów prokariotycznych gen kodujący 18S rRNA mikroorganizmów eukariotycznych Sposób postępowania: amplifikacja fragmentu DNA sekwencjonowanie porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów 5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku

Metody wykorzystujące technikę PCR badanie mieszanej populacji mikroorganizmów

Metody wykorzystujące technikę PCR Geny kodujące białka bakteryjne białko szoku termicznego Hsp 70 białko szoku termicznego Hsp 60 syntaza asparaginylo-tRNA syntaza alanylo-tRNA dehydrogenaza glutaminianowa hydrolaza pirofosforanu podjednostka β polimerazy RNA (RpoB) podjednostka β’ polimerazy RNA (RpoC) czynniki elongacyjne: EF 1α/Tu, EF-Tu, Ef-G/2 białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12 gyrazy

Metody immunochemiczne Reakcja aglutynacji

Metody immunochemiczne Test ELISA

Metody immunochemiczne Test immunochromatograficzny