Skład mieszaniny reakcyjnej PCR Matryca DNA Stężenie matrycy DNA zawiera się w przedziale 0.01-1 ng dla DNA plazmidowego lub fagowego i 0.1-1μg dla DNA genomowego w 50μl mieszaniny reakcyjnej Wyższa ilość matryc DNA (ponad wartości optymalne) najczęściej może powodować wzrost wydajności syntezy niespecyficznych produktów reakcji PCR jeśli wierność syntezy jest czynnikiem decydującym, to połączenie maksymalnej dopuszczalnej ilości DNA w mieszaninie reakcyjnej z ograniczeniem liczy cykli PCR powinno spowodować % wzrost udziału prawidłowych amplikonów PCR Prawie wszystkie rutynowo stosowane metody izolacji DNA pozwalają na uzyskanie matryc wysokiej jakości niewielkie (śladowe) ilości odczynników, które są używane do oczyszczania DNA (fenol, EDTA, proteinaza K, itp.) mocno zahamowują aktywność polimerazy Taq precypitacja DNA 96% etanolem i powtórne przemywanie precypitatu DNA 70% etanolem jest zwykle wystarczające do usunięcia śladowych zanieczyszczeń z preparatów kwasów nukleinowych.

Skład mieszaniny reakcyjnej Startery Startery do PCR są zwykle długości 15-30 nukleotydów Dłuższe startery zapewniają wyższą specyficzność uzyskiwanego produktu Zawartość par GC powinna wynosić od 40 do 60% Nukleotydy C i G powinny być rozmieszczone równomiernie w całej sekwencji startera Więcej niż 3 nukleotydy G lub C na końcu 3’ startera mogą sprawić niespecyficzne wiązanie startera starter nie powinien być komplementarny względem siebie lub komplementarny do żadnego innego startera w mieszaninie reakcyjnej, w celu uniknięcia tworzenia dimerów lub struktur wyższego rzędu temperatura topnienia starterów flankujących nie powinna różnić się więcej niż 5ºC, dlatego też zawartość par GC i długość muszą być wybrane odpowiednio powinny być uwzględnione wszystkie możliwe miejsca komplementarności pomiędzy starterami i matrycą DNA

Tm = 81.5 + 16.65 (log10 [Na+]) + 0.415 (%G+C) – 675 / n Szacowanie temperatury topnienia startera, jeśli starter jest krótszy niż 25 nukleotydów, przybliżona temperatura topnienia (Tm) jest obliczana przy użyciu następującej formuły: Tm= 4 (G + C) + 2 (A + T) G, C, A, T – ilość poszczególnych nukleotydów w starterze Tm 22-nukleotydowego startera o 59% udziale par GC, obliczona według tej formuły wynosi (13 – G+C, 9 – A+T) Tm= 4 (6 + 7) + 2 (4 + 5) = 4(13) + 2(9) = 70ºC Dla porównania oszacowana temperatura topnienia 22-nukleotydowego startera o 60% udziale par GC w 50 mM KCl według innej formuły wynosi: Tm = 81.5 + 16.65 (log10 [Na+]) + 0.415 (%G+C) – 675 / n [Na+] - stężenie molowe, [K+]=[Na+], n = liczba par zasad w starterze. Tm = 81.5 + 16.65 (log10 0.05) + 0.415 (60) – 675/22 = 81.5 + 16.65 (-1.30) + 24.60 – 30.68 = 53.84°C

Temperatura przyłączania startera powinna być obniżona o około 5ºC niż temperatura topnienia (inne podejście zakłada, że powinna być wyższa o 3ºC od tej temperatury) Jeśli starter jest dłuższy niż 25 nukleotydów, Tm powinna być wyznaczana poprzez zastosowanie wyspecjalizowanych programów komputerowych, które uwzględnią wzajemne oddziaływanie sąsiadujących zasad, wpływ koncentracji soli itp.

Stężenie MgCl2 jony Mg2+ tworzą kompleksy z nukleotydami, starterami i matrycą DNA optymalne stężenie MgCl2 powinno być dobierane do każdego eksperymentu oddzielnie Zbyt mało jonów Mg2+ powoduje słabą wydajność produktów PCR, nadmiar Mg2+ powoduje pojawianie się niespecyficznych produktów PCR oraz błędy w samym produkcie Niższe stężenia Mg2+ wskazane są wtedy, gdy dokładność syntezy DNA jest czynnikiem decydującym Rekomendowana rozpiętość stężeń MgCl2 wynosi 1-4 mM Przy stężeniu końcowym nukleotydów wynoszącym 0.2 mM, stężenie MgCl2 zawiera się pomiędzy 1.5±0.25mM (tradycyjny bufor PCR z KCl), i 2.0±0.5mM (bufor PCR z (NH4)2SO4). Bufor z (NH4)2SO4 jest odpowiedni do większości zastosowań Jeśli próbki DNA zawierają np. EDTA stężenie MgCl2 w mieszaninie reakcyjnej powinno być zwiększone

Mieszanina nukleotydów (dNTP) Stężenie każdego z nukleotydów w mieszaninie reakcyjnej wynosi zwykle 100-200µM (0.1-0.2 mM) Jest bardzo ważne, aby stężenia poszczególnych nukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) były identyczne niedokładności w stężeniach nawet jednego nukleotydu dramatycznie zwiększają poziom błędów w produktach PCR Jeśli chcemy osiągnąć maksymalną dokładność procesu PCR stężenie dNTP powinno wynosić 10-50µM, ponieważ wierność amplifikacji jest najwyższa właśnie w tym zakresie stężeń Polimeraza Taq Zazwyczaj stosujemy 1-1,5 jednostki polimerazy w 50μl mieszaniny reakcyjnej Wyższe stężenia polimerazy mogą powodować syntezę produktów niespecyficznych W sytuacji, gdy w mieszaninie reakcyjnej występują różnego rodzaju inhibitory (np. jeśli używana matryca DNA nie jest dokładnie oczyszczona), zalecane są wyższe stężenia polimerazy (2-3 jednostki/50μl).

Profil termiczny Cykl denaturacji wstępnej Parametry amplifikacji zależą głównie od: matrycy sekwencji starterowych termocyklera Cykl denaturacji wstępnej Kompletna denaturacja matrycy DNA na początku reakcji PCR ma kluczowe znaczenie Niekompletna denaturacja DNA wpływa na mało wydajne wykorzystanie matrycy w pierwszym cyklu amplifikacji i słabą wydajność produktu PCR Denaturacja wstępna powinna być wykonana przez okres 1-3 min w temperaturze 95ºC, jeśli udział par GC w matrycy jest mniejszy lub równy 50% Okres ten powinien być wydłużony do 10 minut dla matryc bogatych w pary GC (>50%) Jeśli denaturacja wstępna jest nie dłuższa niż 3 minuty w 95ºC polimeraza Taq może być dodana do mieszaniny reakcyjnej przed cyklem denaturacji Jeśli konieczne jest zastosowanie dłuższego czasu denaturacji albo wyższej temperatury, polimeraza powinna być dodana tylko po okresie, albowiem stabilność enzymu dramatycznie obniża się w temperaturach ponad 95ºC.

Profil termiczny Cykl denaturacji właściwej denaturacja przez okres 0.5-2 minut w temperaturze 94-95°C zazwyczaj jest wystarczająca, albowiem syntetyzowany w pierwszym cyklu produkt PCR jest znacząco krótszy niż matryca DNA i jest kompletnie denaturowany w tych warunkach. Jeśli amplifikowany fragment DNA charakteryzuje się bardzo dużym udziałem par GC, czas denaturacji może być wydłużony do 3-4 minut Alternatywnie, można dodać do mieszaniny PCR substancje ułatwiające denaturację DNA np. glicerol (do 10-15% objętości), DMSO (do 10%) lub formamid (do 5%) W obecności tych dodatków, temperatura przyłączania starterów powinna być ustalana eksperymentalnie, ponieważ temperatura topnienia dupleksu starter-matryca DNA obniża się istotnie Jeśli stosujemy wymienione powyżej dodatki ułatwiające denaturację, ilość polimerazy Taq w mieszaninie reakcyjnej powinna być zwiększona, ponieważ DMSO i formamid, w proponowanych stężeniach, obniżają aktywność enzymu około 50%.

Profil termiczny Cykl przyłączania starterów Zazwyczaj optymalna temperatura przyłączania starterów jest o 5ºC niższa od temperatury topnienia dupleksu starter-matryca DNA Czas inkubacji starterów wynosi zwykle od 30 sekund do 2 minut Jeśli występują niespecyficzne produkty reakcji PCR (oprócz właściwych, specyficznych), temperatura przyłączania starterów powinna być zoptymalizowana poprzez podwyższanie jej o 1-2ºC. Cykl wydłużania (syntezy) produktów PCR Zwykle cykl wydłużania wykonywany jest w temperaturze 70-75ºC Szybkość syntezy DNA przez polimerazę Taq jest najwyższe właśnie w tej temperaturze (2-4 tys. par zasad/minutę) 1 minutowy czas wydłużania jest wystarczający do syntezy fragmentów PCR do około 2 tys. par zasad. Kiedy amplifikujemy dłuższe fragmenty DNA (amplikony), czas syntezy jest zwykle wydłużany do 1 minuty na każde 1000 pz amplifikowanego fragmentu DNA.

Profil termiczny Cykl wydłużania końcowego Liczba cykli Po ostatnim cyklu, próbki przechodzą zwykle okres inkubacji w temperaturze 72ºC przez 5-15 minut, aby wypełnić końce nowo syntetyzowanych produktów PCR Dodatkowo, w czasie tego cyklu, aktywność transferazy polimerazy Taq pozwala na dodanie nukleotydów A na końcach 3’ produktów PCR Dlatego, jeśli fragmenty PCR są klonowane do wektorów T/A, cykl ten może być wydłużony nawet do 30 minut. Liczba cykli Liczba cykli PCR zależy od zawartości (ilości) matryc DNA w mieszaninie reakcyjnej, i od oczekiwanej wydajności produktu PCR Dla mniej niż 10 kopii matrycowego DNA, powinno się wykonać 40 cykli Jeśli początkowa ilość matryc DNA jest wyższa, 25-35 cykli zwykle wystarcza.

IZOLACJA DNA Z ŻELU AGAROZOWEGO Procedura klonowania genów wymaga umiejętności oczyszczania cząsteczek DNA o ściśle określonej wielkości W tym celu przeprowadza się elektroforezę w żelu agarozowym, wycina prążek o odpowiedniej mobilności i następnie oczyszcza DNA od agarozy Żel agarozowy zawiera substancje mogące negatywnie wpływać na reakcje enzymatyczne z udziałem DNA, dlatego skuteczność oczyszczenia ma kluczowe znaczenie dla powodzenia przeprowadzanych później manipulacji Szczególnie wrażliwe na zanieczyszczenia są ligacja i sekwencjonowanie DNA Istnieje wiele sposobów izolacji DNA z żelu agarozowego, najskuteczniejsze wydają się zestawy oferowane przez dostawców materiałów laboratoryjnych. Działają one najczęściej według następującego schematu: rozpuszczenie żelu adsorpcja DNA przemywanie DNA elucja DNA

1. I get (many) longer unspecific products. What can I do? Decrease annealing time Increase annealing temperature Decrease extension time Decrease extension temperature to 62-68º C Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM. Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant. Take less primer Take less DNA template Take less Taq polymerase If none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s) Combine some/all of the above 2. I get (many) shorter unspecific products. What can I do? Increase annealing temperature Increase annealing time Increase extension time Increase extension temperature to 74-78º C Decrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant Take less primer Take less DNA template Take less Taq polymerase If none of the above works: check the primer for repetitive sequences (BLAST align the sequence with the databases) and change the primer(s) Combine some/all of the above

3. Reaction was working before, but now I can't get any product. Make sure all PCR ingredients are taken in the reaction (buffer, template, Taq, etc) Change the dNTP solution (very sensitive to cycles of thawing and freezing, especially in multiplex PCR) If you just bought new primers, check for their reliability (bad primer synthesis ?) Increase primer amount Increase template amount Decrease annealing temperature by 6-10º C and check if you get any product. If you don't, check all your PCR ingredients. If you do get products (including unspecific ones) reaction conditions as described above. Combine some/all of the above 4. My PCR product is weak. Is there a way to increase the yield? Gradually decrease the annealing temperature to the lowest possible. Increase the amount of PCR primer Increase the amount of DNA template Increase the amount of Taq polymerase Change buffer (KCl) concentration (higher if product is lower than 1000bp or lower if product is higher than 1000bp) Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol. Check primer sequences for mismatches and/or increase the primer length by 5 nucleotides Combine some/all of the above

5. My two primers have very different melting temperatures (Tm) but I cannot change their locus. What can I do to improve PCR amplification? An easy solution is to increase the length of the primer with low Tm. If you need to keep the size of the product constant, add a few bases at the 3' end. If size is not a concern, add a few bases at either the 3' or the 5' end of that primer. 6. I have a number of primer pairs I would like to use together. Can I run a multiplex PCR with them?. How? Very likely, yes. Try amplify all loci seaprately using the same PCR program. If one of the primer pairs yields unspecific products, keep the cycling conditions constant and change other parameters as mentioned above (#1 and #2). Mix equimolar amounts of primers and run the multiplex reaction either in the same cycling conditions or by decreasing only the annealing temperature by 4º C. If some of the loci are weak or not amplified, read below !! 7. How many loci can I amplify in multiplex PCR at the same time? Difficult to say. The author has routinely amplified from 2 to 14 loci. Literature describes up to 25 loci or so. 8. One or a few loci in my multiplex reaction are very weak or invisible. How can amplify them? The first choice should be increasing the amount of primer for the "weak" loci at the same time with decreasing the amount of primer for all loci that can be amplified. The balance between these amounts is more important than the absolute values used !!. Check primer sequences for primer-primer interactions

8. One or a few loci in my multiplex reaction are very weak or invisible. How can amplify them? The first choice should be increasing the amount of primer for the "weak" loci at the same time with decreasing the amount of primer for all loci that can be amplified. The balance between these amounts is more important than the absolute values used !!. Check primer sequences for primer-primer interactions 9. Short PCR products in my multiplex reaction are weak. How can I improve their yield? Increase KCl (buffer) concentration to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Decrease denaturing time Decrease annealing time and temperature Decrease extension time and temperature Increase amount of primers for the "weak" loci while decreasing the amount for the "strong" loci. Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol Combine some/all of the above

10. Longer PCR products in my multiplex reaction are weak 10. Longer PCR products in my multiplex reaction are weak. How can I improve their yield? Decrease KCl (buffer) concentration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant. Increase denaturing time Increase annealing time Decrease annealing temperature Increase extension time and temperature Increase amount of primers for the "weak" loci while decreasing the amount for the "strong" loci Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol Combine some/all of the above 11. All products in my multiplex reaction are weak. How can I improve the yield? Decrease annealing time in small steps (2º C) Decrease extension temperature to 62-68º C Increase extension time Increase template concentration Increase overall primer concentration Adjust Taq polymerase concentration Change KCl (buffer) concentration, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant. Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol Combine some/all of the above

12. Unspecific products appear in my multiplex reaction 12. Unspecific products appear in my multiplex reaction. Can I get rid of them somehow? If long: increase buffer concentration to 1.2-2x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM If short: decrease buffer concentration to 0.7-0.9x, but keep MgCl2 concentration at 1.5-2mM Gradually increase the annealing temperature Decrease amount of template Decrease amount of primer Decrease amount of enzyme Increase MgCl2 concentration up to 3-4.5 mM but keep dNTP concentration constant Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8 µg/µL final concentration). You can also try 5% (v/v, final concentration) DMSO or glycerol If nothing works: run PCR reactions for each (multiplexed) locus individually, using an annealing temperature lower than usual. Compare the unspecific products for each locus tested with the unspecific products seen when running the multiplex PCR. This may indicate which primer pair yields the unspecific products in the multiplex reaction. Combine some/all of the above (Note: primer-primer interactions in multiplex PCR are usually translated into lack of some amplification products rather than the appearance of unspecific products)