担当：D班（41046～41060） 発表：高橋（岳）、田宮、遠山 生理学実習 実験５： 白血球の形態と機能 担当：D班（41046～41060） 発表：高橋（岳）、田宮、遠山

目的 ヒト末梢血を用いて 比重の違いを用い白血球を２群に分ける それぞれの白血球の全体に占める割合を調べ、形態を観察する 好中球の遊走能を調べる

方法 １．末梢血液の採取 ２．赤血球の沈降・除去 ３．白血球の分画採取 ４．標本作成（全血；中間層、ペレット） ５．形態観察

１．末梢血液の採取 肘静脈から21mlの血液を採取する ―1mlは全血白血球の計測に用いる ―残りは分画標本の作成に用いる 　―残りは分画標本の作成に用いる 凝固防止のためヘパリンを十分混和する（注射筒の壁にも塗ってある）

２．赤血球の沈降・除去 多糖類であるデキストランを混和する ―赤血球をからめとることで、効率よく沈降させられる

２．赤血球の沈降・除去 → 沈降前 沈降後 沈降赤血球の上の層を回収して分画にまわす

３．白血球の分画採取 Ficoll-Paque液を加えて遠心分離する

３．白血球の分画採取 中間層 ペレット 単球 リンパ球 好塩基球 好中球 好酸球 赤血球 血小板 Ficoll液の比重（1.077） 1.020 1.050 1.100 1.130 単球 Ficoll液の比重（1.077） リンパ球 好塩基球 好中球 好酸球 赤血球 血小板

３．白血球の分画採取 中間層 　―単球 　―リンパ球 　―好塩基球 ペレット 　―好中球 　―好酸球

３．白血球の分画採取 中間層 ペレット

３．白血球の分画採取 遠心分離の後、中間層・ペレットを抽出し、各分画を洗浄する ―中間層分画は遠心を１回行う 　―中間層分画は遠心を１回行う 　―ペレット分画は一度低張液（0.2％NaCl）を加えて赤血球を溶血させて遠心し、再度洗浄・遠心を行う

４．標本作成 （全血；中間層・ペレット） 計数のための標本 全血：Turk液（低張液）による染色 ―余計な赤血球を除く ４．標本作成 　　（全血；中間層・ペレット） 計数のための標本 全血：Turk液（低張液）による染色 　　　―余計な赤血球を除く 分画：Trypan blueによる染色 　　　―生きている細胞と死んだ細胞とを見分け 　　　　　るために加える →血球計算板で計数

＜結果＞白血球の数（/mm3） 文献値: 5000～8000 個人差がかなり大きい

５．形態観察 形態観察のための標本 May-Giemsa染色を施した後、顕微鏡による観察

５．形態観察―全血 ①好中球 直径10～15μm 桿状または２～５分葉の核 細胞質は淡いピンク色 多数の顆粒

５．形態観察―全血 ②好酸球 直径10～15μm ２～３分葉の核 大きさのそろった赤紫色の顆粒が細胞質全体に広がる

５．形態観察―全血 ③好塩基球 直径10～15μm ２～３分葉核（不定形） 細胞質はやや紫がかったピンク色 顆粒

５．形態観察―全血 ④リンパ球 直径7～15μm 球形の核 細胞質は薄い青色 細胞質が少ない リンパ球の隣は血小板

５．形態観察―全血 ⑤単球 直径12～20μm 不定形（馬蹄形など）の核 細胞質は青色 空胞がある

５．形態観察―中間層 リンパ球！ リンパ球！ リンパ球！ 単球！

５．形態観察―ペレット 好中球！ 好酸球！ 好中球！ 好中球！

＜結果＞①各白血球の割合（％） 全血での結果（データ：D班）

＜結果＞①各白血球の割合（％） 97 84 2 10 1 4 1 88 85 11 13 分画での結果（データ：D班） 中間層 ペレット 班員A 班員B リンパ球 97 84 単球 2 10 好塩基球 好中球 1 4 好酸球 ペレット 班員A 班員B リンパ球 1 単球 好塩基球 好中球 88 85 好酸球 11 13

＜結果＞①各白血球の割合 白血球の主な成分はリンパ球と好中球である 中間層ではリンパ球が殆どを占める ペレットでは好中球が大部分を占める

＜結果＞②白血球の回収率 中間層：25.3％、7.45％ ペレット：61.2％、74.7％ →回収率はあまり良くはない 考えられる理由 　―赤血球を沈降させるときに一緒に失われる 　―数回の洗浄 　―（特に中間層で） 　　　抽出しにくい・リンパ球が壊れやすい

＜結果＞③分画効率 中間層：99％、96％ ペレット：99％、98％ 　→概ね分画はうまくなされている 　　　若干のコンタミネーションはある

実験２ 白血球の遊走能の測定

実験の目的 目的 白血球を分画して得られた好中球がメインの細胞浮遊液を用いて、好中球の遊走を観察する。走化性物質と阻害剤を加えて遊走能を定量し、そのメカニズムを理解する。

結果の予測 予測 １．走化性物質の濃度が高いほど遊走能 は高くなる。 ２．阻害剤を入れると遊走は止まるかとて も遅くなる。

操作手順 　１．アガロースプレートの作成 　２．ｆMLP溶液の希釈 　３．好中球遊走の観察

アガロースプレートの作成 材料 １．MEM（Minimum Essential Medium） ２．牛胎児血清･･･細胞の栄養 ３．NaHCO3・・・インキュベーターでのCO2 　との緩衝液

アガロースプレートの作成 穴あけ 半径方向に沿って穴開け機で３ｍｍ径のウェルを３ｍｍ間隔で放射状に四列作る。必ず底まで穴を開けること。

操作手順 　１．アガロースプレートの作成 　２．ｆMLP溶液の希釈 　３．好中球遊走の観察

好中球遊走の観察手順 （好中球を含む）細胞浮遊液を二群に分け、一方はcytochalasinBを加え、一方は対照群としてDMSOを加える。 それぞれの群で、各濃度のfMLPと細胞浮遊液を右図のようにウェルに分注していく。 二時間CO2存在下で培養。 外、内への遊走距離を測定し、その差（外－内）を取る。それぞれをグラフ化する。 内側：対照液　外側：fMLP　中:細胞浮遊液 細胞浮遊液 外 内 遊走

観察の実際 遊走距離（外側） エッジ ｆMLP溶液 細胞浮遊液

前半班の遊走距離 考察１

考察１：なぜある濃度以上では移動距離が減少するのか？ ★好中球遊走のメカニズム 予測と 違うじゃん!! Stop！ Ｙ ： fMLP Receptor 好中球の ウェル ｆＭＬＰの ウェル Move→ Move→ 答え：ある濃度以上では進行方向のレセプターが飽和し、 　　　反対側のレセプターが埋まってゆくだけだから。 　　　また、レセプターの脱感作もある。

前半班の遊走距離 考察２

考察２：なぜ内側にも ある程度の距離を動くのか 遊走には二種類ある １．方向性を持った遊走 →主に外側への遊走 ２．ランダムな遊走 →内側へ動いた距離分、同心円状に動く 遊走範囲の概形 外側 好中球のウェル 内側

前半班の遊走距離 考察３

考察３：cytochaｌasinBの働きは？ 内側への移動も阻害されている。 →受動的な拡散ではなくランダムな遊走により動いていることの証拠である。

B班（後半班）の遊走距離 考察６

考察４：高濃度ｆMLPで内側への移動距離が増えたのはなぜか？ ほぼ全ての走化性因子は、走化性遊走だけでなくランダム遊走も促進する。

終了 文責：田中　優（実験１） 須田　万勢（実験２）

走化性の補足と 追加考察

Chemotaxis（走化性）のmechanism 濃度勾配 (空間微分）を検出 直接測る 経時変化 (時間微分）を検出しながら動く。 　　　　　(adaptation（適応）の利用） *adaptation はdynamic range（測定可能範囲）を広げるのにも大事！

時間微分の例ーbacteriaの鞭毛 ２-stateを行き来 真っ直ぐ進む randomに方向転換 直進 直進 スイッチ切り替え 方向転換 （回転方向による）

Adaptationの利用 ligand 濃い方へ向かうときは向きを変えない！ signal Negative Feedbackで適応 鞭毛 ⇒濃度の経時変化を検出可能 Nature Vol 393 7 May 1998

空間微分 ー細胞骨格を持つEukaryoteの場合 両sideの濃度差を感知（Rho） その方向にActinの足を伸ばす PI3KからPH domainへ 更にactin 重合 fMLPRはformylated methionineを検出するものである。 Lamelipodia (葉状仮足) -偽足ではない (EMBO vol5 NO1 2004 &nature 624,vol5, 2004)

Actin の ＋ endをcapして重合をblock Cytochalasin B

濃度差増幅のmechanism Dyneinが中心体をactinの足場から引っ張る その方向へのactin重合促進 ⇒運動方向の一貫化 核 運動方向 Actinの足場 Dyneinが中心体をactinの足場から引っ張る その方向へのactin重合促進 ⇒運動方向の一貫化 　　微小な濃度差の増幅

Adaptationーdynamic rangeの確保 引っ込める ぶっ壊す R不活化 Signal不活化 Negative feedback 脱感作（鈍らせる）で高濃度でも濃度差検出 高濃度で遊走能が落ちた理由は振り切れ（ex.電流計）と呼ぶ方が適切であろう。

後半班の遊走距離 追加考察１

追加考察１：なぜ後半班では最高濃度で移動距離が落ちなかったのか？ 可能性としては １．fMLPの濃度調整を間違えて薄い液を 作ってしまった。 ２．後半斑の白血球（田宮寛之）の好中球のfMLP感度に対する感度が、前半班のもの（高橋岳浩）より鈍かった。 ボクは鈍感！

追加考察２：内側と左右の遊走距離がほぼ等しいのはなぜか？ 今回のウェルの作り方だとｆMLPの二次的な濃度勾配が形成された可能性が高い。 →①～③がほぼ等距離であることから、一度好中球のウェル内に均等拡散したｆMLPが同心円状に浸透 　　遊走範囲の概形 高 外側 内側 ① ② ③ 左 右 低 一次濃度勾配

二次濃度勾配のイメージ図 外 ここではｆMLPが 自由拡散 外のウェル 一次濃度勾配 二次濃度勾配 白血球のウェル いずれにせよ、濃度勾配に逆らって動いているので、内側への運動はrandomな遊走能（化学運動性ーchemokinesis） をそのまま表しているとはいえないであろう。 内