System analizy zachowania zwierząt doświadczalnych w badaniach neurologicznych Dyplomant: Magdalena Mazur Promotor: prof. dr hab. inż. Antoni Nowakowski Konsultaci: dr inż. Mariusz Kaczmarek, dr med. Bartosz Karaszewski

Cel pracy Celem niniejszej pracy jest opracowanie automatycznego systemu rejestracji i oceny zachowania zwierząt doświadczalnych (myszy) w różnych modelach chorób neurologicznych, w badaniach prowadzonych w Klinice Neurologii AMG. System powinien ilościowo opisywać zmiany zachowania zwierząt, ich sprawności, objawów nietypowych zachowań w zależności od różnych czynników, takich jak podawane leki lub inne. Najbardziej widoczne zmiany zaistnieją w szybkości poruszania się myszy, preferencji jednej strony (odwrotnej do tej, w której zaszło uszkodzenie w mózgu), jakości pokonywania przeszkód.

Cel pracy Celem badań jest zdefiniowanie wskaźników do obiektywnej charakteryzacji stanu zwierzęcia. System ma na celu zastąpienie nużącej dla człowieka obserwacji obiektów poprzez automatyczną akwizycję danych. Zastępuje standardowe metody doświadczalne (tzw. „stoper, kartka i ołówek”), rejestruje parametry czasoprzestrzenne, ale automatycznie nie rozpoznaje zachowania zwierząt.

Obiekt doświadczalny Obiektem doświadczalnym są myszy. Zabiegi, którym będą one poddawane, polegają na wywołaniu uszkodzenia mózgu (odpowiadające uszkodzeniom po udarze mózgu), a następnie podawaniu różnych leków i ich sekwencji. Zwierzęta, u których doszło do uszkodzenia mózgu z powodu patologii odpowiadających najczęstszym chorobom u ludzi, jak udar mózgu lub choroby zwyrodnieniowe centralnego układu nerwowego, będą charakteryzowały się takimi zaburzeniami fizykalnymi, jak: niedowłady kończyn, niedoczulice kończyn, zaburzenia pola widzenia, zaburzenia równowagi, porażenie połowiczne itp. Zachowania te powinny wpływać na zachowania się myszy w torze testowym, co będzie przedmiotem badań projektu.

Przedsięwzięcie polegało na: zaprojektowaniu i zbudowaniu toru przeszkód, po którym poruszają się badane zwierzęta; stworzeniu systemu automatycznej akwizycji danych, w celu gromadzenia informacji o specyficznym zachowaniu zwierząt; opracowaniu oprogramowania analizy obrazów (w szczególności identyfikacji obiektu ruchomego), systemu zarządzania danymi i oceny postępu leczenia zwierząt; zdefiniowaniu parametrów oceny stanu neurologicznego zwierzęcia.

Projekt – część sprzętowa System składa się z: Toru przeszkód (A), Kamery internetowej na statywie dającej obraz z góry (B), Kamery internetowej na statywie przymocowywanym do blatu stołu skierowanej na moduły toru zawierające przeszkody (C), Komputera z oprogramowaniem (D).

Projekt – część programowa System informatyczny składa się z: Programu głównego napisanego w Borland C++ Builder, przechwytującego obraz z kamer, wykrywającego i analizującego ruch oraz komunikującego się z bazą danych, Bazy danych stworzonej w MySQL, przechowującej dane na temat myszy, zabiegów, doświadczeń itp., Interfejsu bazy danych utworzonym w HTML i PHP, który pozwala na szybkie i łatwe zarządzanie i przeglądanie danych, Wizualizacji wyników, program napisanej w PHP, przedstawiający wykresy.

Zasada działania Program główny steruje kamerami oraz przechwytuje dane przesyłane interfejsem USB. Na podstawie tych danych tworzony jest obraz wideo, z którego program wyodrębnia poszczególne klatki. Każda klatka filmu jest analizowana, a z wyników wszystkich obrazów obliczane są określone parametry całego nagrania. Parametry te, wraz z danymi określającymi nagranie, zapisywane są w bazie danych. Interfejs bazy danych pozwala obejrzeć, zmienić lub usunąć te dane. Program ilustrujący wyniki statystyczne, przy każdorazowej próbie uruchomienia pobiera aktualne dane z bazy danych i na ich podstawie wykonuje analizę, a następnie przedstawia wyniki w postaci graficznej.

Rejestrowane parametry: czas przejścia myszy przez poszczególne części toru – Ti; czas całkowity przejścia myszy przez tor - Tc; wybór przez mysz strony w rozgałęzionym module - L, P; preferencję strony (poruszanie się wzdłuż którejś ze stron), średnia odchyleń od środka modułu w każdym momencie – l, p; ilość „wpadnięć” łapek myszy w przeszkodę wykonaną z siatki – n; położenie myszy jako współrzędne dwuwymiarowe – a, b.

Etapy wykonania doświadczenia Podłączenie elementów systemu i uruchomienie potrzebnych aplikacji, Wybór opcji nagrania, wprowadzenie nazwy myszy oraz kalibracja kamer, Wpuszczenie myszy do pomieszczenia toru oraz rozpoczęcie nagrania, Zakończenie nagrania po przejściu toru przez mysz oraz zatwierdzenie wyników otrzymanych z analizy obrazu, Oglądanie wyników, statystyk oraz zarządzanie danymi poprzez interfejs bazy danych.

Interfejs aplikacji

Interfejs bazy danych i analizy statystycznej

Najważniejsze cechy systemu: System działa w czasie rzeczywistym, Jest odporny na zakłócenia zewnętrzne (cienie, niewielkie zmiany natężenia oświetlenia), Jest odporny na zakłócenia wewnętrzne (zmiana kierunku ruchu myszy, wystąpienie innych niż mysz ciemnych punktów na analizowanym obrazie), Analizuje obraz z dwóch kamer jednocześnie i niezależnie, Zajmuje relatywnie mało pamięci operacyjnej i dyskowej, Jest przystępny, łatwy w obsłudze, Jest przenośny – działa jednakowo na różnych platformach, Jest rozszerzalny – pozwala na rozbudowę i dodawanie funkcji, Nie jest odporny na ruchy kamery w czasie nagrania, Może być używany tylko dla pewnego rodzaju myszy.

Wyniki badań Wyniki doświadczeń przeprowadzono na dwóch zdrowych myszach, młodej i starej. System poprawnie reaguje na położenie myszy, rejestruje jej przejście przez tor oraz wszystkie parametry. Niekorzystnym czynnikiem przeprowadzonych badań jest to, że zwierzęta nie były przyzwyczajone do tego, iż na końcu toru znajduje się pożywienie. Często zatrzymywały się one lub zawracały, co negatywnie wpłynęło na wyniki badań. Myszy przestraszone poruszały się przy ściankach toru, co powodowało wykrycie znacznej preferencji jednej ze stron przez program. Dla starszej myszy (mysz nr 1) system zarejestrował jedno wpadnięcie łapy w kratkę.

Wnioski System spełnia wcześniejsze założenia, pracuje w czasie rzeczywistym, analizuje obraz otrzymując parametry stanu motorycznego badanego obiektu, wykonuje obliczenia statystyczne. Z powodzeniem może być używany do przeprowadzania doświadczeń zmian zachowania zwierząt doświadczalnych w badaniach neurologicznych. Możliwe jest także rozszerzanie systemu o nowe funkcje.