Natalia Mieczysławska MECHANIZMY STABILNEGO DZIEDZICZENIA PLAZMIDÓW NA PRZYKŁADZIE PLAZMIDU pSM19035 Natalia Mieczysławska

plazmidy - samodzielne pozachromosomowe replikony losowy rozdział plazmidów do komórek potomnych systemy wspomagania stabilnego dziedziczenia plazmidów systemy post-segregacyjnego zabijania (PSK) charakterystyka plazmidu pSM19035

PLAZMIDY Samodzielne pozachromosomowe replikony występują u bardzo wielu organizmów prokariotycznych oraz u niektórych eukariontów cechuje je zdolność do trwałego utrzymywania się (stable maintenance) w komórce i replikowania się w niej w kontrolowany sposób bardzo różnorodne pod względem rozmiarów, struktury i funkcji odgrywają znacząca rolę w zdolnościach adaptacyjnych prokariontów i w konsekwencji w ich ewolucji Plazmidy bakteryjne zdolne są do autonomicznej replikacji, za którą odpowiedzialne są regiony (zwykle 1-3kb) zawierające geny kodujące białka replikacyjne, sekwencje regulatorowe oraz miejsce startu replikacji.

LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH wielkość plazmidu i liczba jego kopii w komórce odgrywa bardzo ważną rolę w stabilnym dziedziczeniu Jeżeli założymy, że podczas losowego rozdziału każda z cząsteczek plazmidu ma takie same szanse dostania się do jednej z dwóch komórek potomnych, wówczas komórki bezplazmidowe będą pojawiać się w populacji z częstością zależną od liczby kopii plazmidu zgodnie ze wzorem (Nordström i Austin 1989r.) : PLAZMIDY: (1kb-1,7Mb) małe średnie duże megaplazmidy jednokopiowe niskokopiowe (2-8 kopii na komórkę) wysokokopiowe P - prawdopodobieństwo powstania komórki bezplazmidowej (tzw. czystość segregacji plazmidu) n - liczba kopii plazmidu jeżeli n =2 komórki bezplazmidowe powinny pojawić się już po 2 podziałach, jeżeli n =20 częstość segregacji wynosi mniej niż 10 -6

LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH od częstości segregacji zależy segregacyjna stabilność plazmidów jest to wystarczające dla stabilnego dziedziczenia w przypadku plazmidów wysokokopiowych

LEPSZY NIŻ LOSOWY ROZDZIAŁ PLAZMIDÓW DO KOMÓREK POTOMNYCH W rzeczywistości nawet plazmidy o niskiej liczbie kopii są niezwykle trwale utrzymywane w populacjach bakteryjnych, niezależnie od braku presji selekcyjnej Istnieją specyficzne mechanizmy stabilnego dziedziczenia plazmidów: System miejscowo specyficznej rekombinacji (wspomaga jedynie rozdział losowy plazmidów) System aktywnego rozdziału (partycji) Systemy post-segregacyjnego zabijania (addykcyjne)

SITE-SPECIFIC RECOMBINATION SYSTEMS KATASTROFA DIMEROWA Powstawanie dimerów lub form oligomerycznych wyższego rzędu wśród identycznych kopii plazmidów problem z miejscami ori częstsze niż oczekiwane powstawanie komórek bezplazmidowych plazmidy kodują tzw. mrs (multimer resolution system) przeciwdziałający utrzymywaniu się form oligomerycznych w komórce system ten tworzy miejscowo-specyficzna rekombinaza (resolwaza), która rozpoznaje tzw.sekwencje res

ACTIVE PARTITION Wspomagają fizyczny rozdział kopii plazmidów do komórek potomnych konieczne jest: miejsce centromerowe gen kodującego białko wiążące się do DNA rejonu centromerowego gen o właściwościach ATP-azy oba geny, kodujące odpowiednie białka (tworzące kompleks nukleoproteinowy) wchodzą w skład operonu, którego transkrypcja jest przez nie regulowana

PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PSK) Działają po podziale komórki, uzależniają komórkę gospodarza od występujących w niej plazmidów (addykcja) nazywane systemami post- segregacyjnego zabijania (PSK), systemami trucizna - odtrutka, toksyna - antidotum (TA) ideę addykcji zaproponował Koyama w 1975r. zauważając, ze jeśli komórka tracąca plazmid ginie, to w populacji nigdy nie znajdzie się pozbawionych plazmidów komórek potomnych

SYSTEMY ADDYKCYJNE (PSK) Trucizna jest białkiem, antidotum antysensownym RNA Trucizna i antidotum są białkami system ten tworzą przynajmniej dwa geny plazmidowe, warunkujące powstawanie: stabilnej trucizny ( dłuższy okres półtrwania) nietrwałego antidotum (krótki czasie półtrwania)

SYSTEMY PSK REGULOWANE PRZEZ ANTYSENSOWNY RNA zbadane i opisane na przykładzie systemu hok-sok (host killing, supression of killing) znajdującego się na plazmidzie R1 E. coli zawiera on trzy nakładające się geny : hok - kodujący toksynę mok - regulujący translację trwałego mRNA trucizny sok - kodujący nietrwały antysensowny RNA, komplementarny do obszaru 5’ mRNA mok-hok. wysoką trwałość mRNA trucizny powoduje występująca na jego 3’ końcu strukturze fbi (fold back inhibition)

PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS)

PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS) dwa (lub trzy) geny stanowią operon autoregulacja transkrypcji: antidotum samo lub w kompleksie z trucizna działa jako represor promotora

PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS) podobieństwa strukturalne i funkcjonalne systemów nie ma znaczących podobieństw sekwencji ich genów małe białka (70-130aa) białko trucizny na ogół większe od antidotum

PROTEIN PLASMID ADDICTION SYSTEMS (PPAS) Pomimo intensywnych badań prowadzonych przez ostatnie lata nad różnymi systemami trucizna - antidotum tylko dla nielicznych z nich udało się ustalić molekularny mechanizm działania trucizny

PLAZMID pSM19035 wyizolowany z patogennych komórek klinicznego szczepu Streptococcus pyogenes plazmid niskokopiowy (ok. 2-5 cząsteczek plazmidu na chromosom bakteryjny) plazmid o szerokim zakresie gospodarzy replikuje (według schematu theta) w bakteriach Gram-dodatnich, w których zawartość par G+C w DNA chromosomalnym jest niska koduje oporność na erytromycynę 28975bps prawie 80% cząsteczki stanowią powtórzone sekwencje w komórkach Bacillus subtilis plazmid wykazuje 1000 razy większą stabilność niż wynikałoby to z losowego rozdziału

PLASMID pSM19035 na plazmidzie tym zidentyfikowano dwa rejony zaangażowane w trzy różne procesy stabilnego dziedziczenia: Seg A,  gen   system miejscowo specyficznej rekombinacji. wymaga chromosomalnego histono - podobnego białka komórkowego Hbsu (w Bacillus subtilis) Seg B   oraz -- . lepszy niż losowy rozdział plazmidów genu   aktywny rozdział plazmidów operon --  proces post-segregacyjnego zabijania

SYSTEM -- PLAZMIDU pSM19035 Białko omega jest globalnym regulatorem funkcjonowania genów plazmidu pSM19035: reguluje liczbę kopii plazmidu, działając na gen CopS reguluje ekspresję genu  i wpływa na aktywną partycję jest represorem transkrypcji operonu -- gen   antidotum Epsilon (90aa) proteaza degradująca ClpXP gen   trucizna Zeta (287aa) gen   białko Omega (71aa)

OMEGA JAKO GLOBALNE BIAŁKO REGULATOROWE KONTROLA LICZBY KOPII AKTYWNA PARTYCJA SYSTEM PSK

SYSTEM -- PLAZMIDU pSM19035 brak znaczącego podobieństwa do znanych sekwencji wśród sekwencji kodujących białka Zeta, Epsilon i Omega jedyny dobrze rozpoznawalny motyw jest obecny w N-końcowym rejonie Zety i jest nim ATP/GTP wiążący motyw Walkera (P- loop) wykorzystując drożdżowy system dwuhybrydowy wykazano wzajemne oddziaływanie Zety i białka Epsilon analizując mutanty delecyjne powstałe wskutek ukierunkowanej mutagenezy genów  i  wykazano wzajemne oddziaływanie N- końca białka Epsilon i N-końca białka Zeta udało się również wykrystalizować (Meinhart 2003r.) kompleks białek trucizny i odtrutki (Epsilon2Zeta2)

STRUKTURA BIAŁKA OMEGA

PRZYSZŁOŚĆ WNIOSKI KOŃCOWE Identyfikacja rejonu trucizny Zety odpowiedzialnego za toksyczne działanie znalezienie celu dla działania trucizny WNIOSKI KOŃCOWE Niskokopiowe plazmidy o szerokim zakresie gospodarzy stanowią bardzo interesujący obiekt badawczy: wektory, również jako wektory miedzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi konstrukcje nowych leków antybakteryjnych wykorzystanie plazmidowych systemów post segregacyjnego zabijania w walce z patogennymi drobnoustrojami (środki farmakologiczne nowej generacji)