Metody biologii molekularnej roślin Wykład 2 Metody biologii molekularnej roślin

Podstawowe techniki biologii molekularnej stosowane w badaniach roślin Klonowanie; Biblioteki genowe; Banki; Bazy danych; Analiza makrocząsteczek/ elektroforeza; PCR; Sondy: Southern-, Northern-, Western-blotting, Immunodetekcja; Hybrydyzacja in situ; FISH; Transkrypcja/translacja in vitro; Ekspresja cDNA; Badania białek, Chromatografia powinowactwa; System dwuhybrydowy; Bioinformatyka

Klonowanie Procedura zmierzająca do uzyskania pojedynczych genów w postaci fragmentów DNA chromosomowego (genomowego) lub kopii transkryptów (cDNA – complementary DNA). Polega na wykorzystaniu innego organizmu (np. drożdży lub E. coli) do zreplikowania fragmentu DNA. Wymaga wektora (autonomicznie replikującego się fragmentu DNA). Dla bakterii wektorami są plazmidy lub wirusy, np. bakteriofag labmda (λ) DNA jest przecinany w określonych miejscach enzymami restrykcyjnymi. Powtórne łączenie przeciętych fragmentów DNA wymaga ligacji za pomocą enzymu: ligazy DNA.

Podstawowy schemat klonowania

Transformacja E. coli plazmidem Przykładowy protokół Transformacja E. coli plazmidem

Przygotowanie komórek kompetentnych (metoda z CaCl2) 1. Załóż hodowlę kolonii E. coli na szalkach z LB. 2. Przenieś pojedynczą kolonię do 100 ml pożywki LB w 500 ml kolbie z odpowiednim antybiotykiem.  Prowadź hodowlę w wytrząsarce w 37 o przy 300 obr./min aż do połowicznej fazy logarytmicznej (O.D. 600nm ok. 0.6). 3. Przenieś hodowlę do wyziębionych 50 ml probówek wirówkowych. Schłodź w lodzie przez 10 min.. 4. Zwirój komórki przy 3000 obr./min w 4oC przez 10 min. 5. Zlej supernatant. Zawieś osad w 20 ml lodowatego 0.1M CaCl2 . 6. Trzymaj w lodzie przez 5-10 min. 7. Zwirój komórki powtórnie przy 3000 obr./min w 4oC przez 10 min. 8. Zdekantuj supernatant. Postaw probówki odwrócone na bibule, aż do ścieknięcia cieczy. 9. Zawieś osad w 2 ml  lodowatego 0.1M CaCl2 .

Transformacja   10. Przenieś 200µl kompetentnych komórek do probówki do mikrowirówki. 11. Dodaj 10µl plazmidu (2 ng/µl). 12. Wymieszaj zawartość i umieść w lodzie na 30 min. 13. Przenieś probówki do łaźni o temp. 42oC na 90 sek. 14. Schłodź probówki w lodzie przez 1-2 min. 15. Dodaj 800µl pożywki LB. Inkubuj w 37oC przez 45 min. 16. Rozprowadź różne ilości transformantów na szalkach LB z ampiciliną (30µg/ml): (i) 10µl + 90 µl LB (ii) 100µl bez rozcieńczania LB. 17. Inkubuj szalki w 37oC przez noc. 18. Oblicz wydajność transformacji (liczba koloni/ug DNA)

Warianty klonowania

Biblioteki genowe Biblioteki genomowe: w różnych typach wektorów, np. W plazmidach – od kilkuset do kilku tysięcy pz. do uzyskiwania sond hybrydyzacyjnych do diagnostyki lub mapowania genów (RFLP) W wektorze fagowym (kosmidy) (10-35 Kb) – do uzyskiwania komplentnych genów W YAC (Yeast Artifical Chromosome) lub BAC do klonowania fragmentów chromosomów (50-400 Mb) Przeszukiwanie bibliotek: sondy genowe lub PCR. Zbiory pojedynczych genów (fragmentów DNA) utrzymywane w oddzielnych bakteriach. Stanowią materiał wyjściowy do poszukiwania genów. Biblioteki cDNA : odwzorowania transkryptów (RT-PCR) – sekwencje kodujące genów. Biblioteki genomowe: reprezentują cały genom (geny i rejony międzygenowe); geny: sekwencje kodujące (introny + eksony) i regulatorowe (promotory)

Banki i Bazy danych Postęp technik sekwencjonowania w ostatnich dekadach. Do dziś zakończono sekwencje kilkudziesięciu genomów bakteryjnych i genomów prostych eukaryota (np. Saccharomyces cerevisiae -drożdże piekarskie) Dostępne są też całe sekwencje genomowe wielkomórkowych eukaryota, w tym: psa, mszy, szympansa, Drosophila, C. elegans i A. thaliana, ryżu Human Genome Project, zakończył się zsekwencjonowaniem wszystkich 24 ludzkich chromosomów. Szczegółowe dane wciąż spływają. Zasoby baz danych np. GeneBank lub EMBL, rosną w tempie wykładniczym. Ogromna ilość informacji wymaga b. starannej organizacji przechowywania i analizy danych. Zastosowanie informatyki w biologii doprowadziło do powstania dziedziny zwanej Bioinformatyką.

Banki i Bazy danych-przeszłość i prognoza Większość biologicznych baz danych zawiera informacje o sekwencjach nukleotydowych i aminokwasowych. Istnieją także bazy danych zawierające informacje o strukturalnych i biochemicznych cechach organizmów. Wartość informacyjna i prostota zastosowania informacji o sekwencjach powodują, że są one najczęściej wykorzystywane. 2008

Rzeczywistość

Przyrost liczby biologicznych baz danych 1998-2002

Bioinformatyka Najprostszym i podstawowym zadaniem bioinformatyki jest tworzenie i utrzymywanie baz danych informacji biologicznych. Większość tych baz zawiera sekwencje kwasów nukleinowych (i pochodzące z nich sekwencje aminokwasowe). Przechowywanie i organizacja informacji o miliardach nukleotydów nie jest zadaniem trywialnym; zaprojektowanie bazy danych i rozwój interfejsu umożliwiającego badaczom dostęp do zgromadzonej informacji i jej uzupełnianie o nowe dane - to tylko początek.

Bioinformatyka/Biologia obliczeniowa Najważniejszym celem bioinformatyki jest analiza informacji o sekwencjach. Zadanie to realizuje biologia obliczeniowa (Computational Biology), która zajmuje się: Odnajdywaniem genów w sekwencji DNA różnych organizmów. Opracowywaniem metod przewidywania struktury i/lub funkcji nowo odkrywanych białek i niekodujących RNA. Grupowaniem sekwencji białkowych w rodziny pokrewnych sekwencji i rozwojem metod pozwalających na modelowanie białek. Porównywaniem (alignment) pokrewnych białek i tworzeniem drzew filogenetycznych pozwalających na wyciąganie wniosków ewolucyjnych.

Analiza makrocząsteczek/ elektroforeza Białka: SDS-PAGE Wzorce masy cząsteczkowej białek (w nanogramach) rozdzielone w 12% żelu poliakrylamidowym z SDS i wybarwione barwnikiem Coomassie Fluor Orange

Analiza makrocząsteczek/ elektroforeza Rozdzielczość SDS-PAGE Z dobrego żelu SDS-PAGE można określić: względną M.Cz. w D lub kD jednego białka w stosunku do drugiego Dokładną M.Cz. białka, jeśli dostępne są odpowiednie wzorce.

Elektroforeza białek – różne metody detekcji Wykrywanie glikoprotein wśród innych białek w SDS-PAGE za pomocą zestawu do barwienia glikoprotein (Glycoprotein Gel Stain Kit). Markery M.Cz. glikoprotein zawierające na przemian białka glikozylowane i nie glikozylowane rozdzielono w 13% żelu poliakrylamidowym. Żel wybarwiono barwnikiem „SYPRO Ruby” wykrywającym wszystkie 8 białek markerowych (lewa ścieżka). Żel wybarwiono następnie na glikoprioteiny wykrywając: 2-makroglobulinę, oksydazę glukozową, 1-glikoproteinę i awidynę (prawa ścieżka)

Elektroforeza białek – barwienia wybiórcze Dwukrotne rozcieńczenia trzech różnych lizatów E. coli, każdy wyrażający fuzję rekombinowanego białka z oligohistydyną, rozdzielono w żelu poliakrylamidowym. Po elektroforezie żel wybarwiono barwnikiem Pro-Q Sapphire 365 wykrywającym oligohistydynę (górny żel). Po sfotografowaniu, żel wybarwiono barwnikiem SYPRO Ruby (dolny żel).

Elektroforeza białek – żele 2D (dwuwymiarowe) Porównanie dwóch próbek białkowych rozdzielonych na żelu 2-D. Białka z normalnej i nowotworowej wątroby rozdzielono na dwóch żelach 2-D i wybarwiono SYPRO Ruby. Obrazy wybarwionych żeli zeskanowano. Obrazy wybarwionych żeli pokolorowano na różowo lub zielono i nałożono. Zielone plamki – białka eksprymowane w wątrobie nowotworowej, różowe – w wątrobie normalnej. Czarne plamki odpowiadają białkom eksprymowanym w obu tkankach.

Dostępne spektrometry mas (IBB PAN) Liczba białek identyfikowanych w jednym przebiegu HPLC-MS 150 1000 MudPIT 300 ? Spektrometr Mas LTQ-FT-ICR Linear Ion Trap Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Q-TOF

Otrzymywanie jąder komórkowych Frakcjonowanie

frakcji zidentyfikowane w jednym przebiegu Identyfikacja białek Wyniki W 9-ciu przebiegach HPLC/FT-ICR zidentyfikowano 4255 białek W pojedynczym przebiegu HPLC/FT-ICR można zidentyfikować ponad 1000 białek Białka z różnych frakcji zidentyfikowane w jednym przebiegu

MudPIT Multidimentional Protein Identification Technique Zalety metody: możliwość wykrycia około 1000 białek w próbce szybka i mało pracochłonna metoda nadaje się do analizy całych proteomów Wady metody: trudna analiza danych skomplikowany sprzęt HPLC długotrwałe przebiegi HPLC-MS (około doby na próbkę) MudPIT Multidimentional Protein Identification Technique

Elektroforeza DNA (fragmentacja DNA w apoptozie) DNA wyizolowano z komórek HL-60 traktowanych kamptotecyną, rozdzielono w żelu agarozowym i wybarwiono SYBR Green I, barwnikiem wykrywającym kwasy nukleinowe. Widać „drabinkę fragmentów o wielkości od 200 to 5000 pz charakterystyczną dla komórek w stanie apoptozy.

Elektroforeza DNA po trawieniu enzymem restrykcyjnym HaeIII Seria rozcieńczeń DNA faga PhiX174 RF trawionego enzymem Hae III i rozdzielonego w 5% żelu poliakrylamidowym, barwienie SYBR Green. Prążki widoczne po naświetleniu żelu światłem UV o długości 254 nm.

Sondy (probes)/hybrydyzacja Southern’a

Wykorzystanie hybrydyzacji Southern do analizy metylacji DNA Arabidopsis w 180 pz powtórzeniach centromerowych (wg. Wierzbicki i Jerzmanowski, Genetics 2005) HpaII CCGG MspI CCGG

Elektroforeza RNA Seria rozcieńczeń16S i 23S rybosomalnego RNA (rRNA) z E. coli po rozdziale w nie denaturującym 1% żelu agarozowym i wybarwieniu barwnikiem SYBR Green II. .

Sondy (probes)/hybrydyzacja Northern Przeniesiony na membranę RNA (po elektroforezie) jest hybrydyzowany z radiaktywnymi sondami.

Looked for small RNA with homology to FLC genomic sequence. Analiza Northern: W całkowitym RNA Arabidopsis znajduje się małe RNA o sekwencji homologicznej do rejonu 3`FLC ATG TAG użyta sonda liście rozety łuszczynki liście pędu kwiaty siewki pęd Looked for small RNA with homology to FLC genomic sequence. Found sRNA with homology to region precisely outside FLC 3`UTR. Small RNA expressed in siliques. sonda do rejonu 3`FLC 30nt 20nt EtBR

Zasada i zastosowania PCR

Analiza poziomu transkrypcji wybranych genów podczas rozwoju A Analiza poziomu transkrypcji wybranych genów podczas rozwoju A. thaliana u roślin dzikich i mutantów atswi3c-1 i atswi3d-1 (wg. Sarnowski et al. Plant Cell 2005)

(wg. Wierzbicki i Jerzmanowski, Genetics 2005) Wykorzystanie RT-PCR do analizy wpływu supresji histonu H1w Arabidopsis na poziom mRNA (wg. Wierzbicki i Jerzmanowski, Genetics 2005) RT-PCR

Wykorzystanie PCR do analizy metylacji rybosomalnego DNA (wg. Wierzbicki i Jerzmanowski, Genetics 2005)

Transkrypcja/translacja in vitro

Ekspresja cDNA w jeden dzień

Systemy do ekspresji cDNA

Immunodetekcja/Western blotting

Zmiany modyfikacji histonów H3 i H4 w odpowiedzi na stres chłodu w komórkach TBY-2 (Sokół et al.. niepublik.) 0,1 3 st. sacharozy w % anty-P(Ser10)-H3 0,1 3 stężenie sacharozy w % min. 0 5 10 15 20 30 60 90 120 min. 0 5 10 15 20 30 60 90 120 anty-P(Ser10)- Ac(Lys14)-H3 anty-Ac-H4 min. 0 15 30 60 90 120 żel SDS western-blot

Badania białek - Chromatografia powinowactwa

Analiza chromatyny za pomocą metody ChIP – czego szukamy? H3 K9 diME H3 K9 diME euchromatyna heterochromatyna

Struktura genu FLC ATG TAG gen FLC FLC is MADS box type transcription factor with 7 exons. showing homology to AGAMOUS (MADS box) in terms of sequence and in terms of it regulation. FLC is a well studied gen. Offers possibility to add new layers of regulation to already discovered.

metoda ChIP - 1 (Chromatin Immuno Precipitation) przeciwciała specyficzne do H3 di-meK9 Experimental method for analyzing the acetylation state of histones in chromatin associated with a specific region of the genome Nucleosomes are lightly cross-linked to DNA in vivo using a cell-premeable, reversible, chemical cross-linking agent. Chromatin is then isolated, sheared to an average length of three nucleosomes, and subjected to immunoprecipitation with an antibody specific for a particular acetylated N-terminal histone sequence. The DNA in the immunoprecipitated chromatin fragment is released by reversing the cross-link and then is quantitated using a sensitive PCR method. Basically at the end of this you can get an idea which genomic regions were associated with histones (as a nucleosome) that were modified. amplifikacja PCR wzbogaconych fragmentów

metoda ChIP – specyficzność przeciwciał ???? Jenuwein T

Wynik analizy: w łuszczynkach rejon 3`FLC jest związany ze znacznikiem H3 K9 di-methyl NoAB ChIP ŁUSZCZYNKI ŁUSZCZYNKI SIEWKI SIEWKI Ta3 rejon 3`FLC

Wzbogacenie w stosunku Wynik analizy: znacznik H3 K9 di-methyl jest ograniczony do rejonu 3`FLC ATG TAG Wzbogacenie w stosunku do kontroli Wzbogacenie zanaczonych reionów w H3 di-me K9; ChIP nad Input

Wykorzystanie GFP do ustalenia, czy siRNA do 3’FLC działa w trans? FLC locus ATG TAG GFP5ER 35S Promoter Terminator sensor construct negative control construct 300nt fragment of AtSN1 positive control construct 35S GFP

Fluorescencji GFP w transgenicznych siewkach sensor positive control negative control

Fluorescencja GFP w transgenicznych łuszczynkach 35S GFP plants Sens b

Sondy/Detekcja białek w komórkach Włókna aktynowe u płazińca Archimonotresis sp. znakowane fluorescencyjnie falloidyną dla uwidocznienia systemu mięśni poprzecznych, okrężnych i diagonalnych. Duży jasny pierścień z włóknami mięśniowymi rozchodzącymi się promieniście na zewnątrz to gardziel, mały jasny pierścień po przeciwnej stronie jest częścią układu reprodukcyjnego.

Sondy/Jednoczesna detekcja kilku białek Komórki nabłonkowe; sondy do aktyny, mitochondriów i fosforylowanej formy histonu H3 Aktyna: niebieska fluorescencja Alexa Fluor 350 phalloidin, Fosfo H3 królicze przeciwciało p-ko fosfo-H3 H3 antibody znakowane Alexa Fluor 555 Rabbit IgG (czerwona fluorescencja). Mitochodria: endogenna biotyna znakowana streptawidiną wykrywana przez królicze przeciwciało p-ko streptawidynien znakowane Zenon Alexa Fluor 488 Rabbit IgG (zielona fluorescencja)

Jednoczesna detekcja białek i DNA Komórki nabłonka inkubowane z barwnikiem MitoTracker Red uwidoczniającym mitochondria. Aktyna wybarwiona fluorescencyjnie falloidyną Jądra komórkowe wybarwione DAPI

Detekcja sekwencji chromosomowych za pomocą FISH -Fluorescent In situ Hybridization

FISH na chromosomach Sondy DNA specyficzne do określonych rejonów poszczególnych chromosomów są znakowane markerami fluorescencyjnymi i hybrydyzowane do rozmazów chromosomowych. Wzmocniony komputerowo obraz chromosomów po hybrydyzacji z sondą

„Chromosome painting” – malowanie chromosomów Sondy DNA specyficzne do odpowiednich rejonów w poszczególnych chromosomach są przyłączane do markerów fluorescencyjnych i hybrydyzowane do preparatu zawierającego rozmaz chromosomów . Zdjęcie pokazuje wygenerowany przez komputer obraz w „sztucznych kolorach”, w którym małe różnice w długości fali widma fluorescencji, po wzmocnieniu, tworzą wyraźne barwy pierwotne. Kombinacja sond hybrydyzujących do poszczególnych chromosomów tworzy dla każdego z nich niepowtarzalny wzór.

Hybrydyzacja in situ: sondy do sekwencji satelitarnych ludzkich chromosomów 1, 15 i 17 Sondy do sekwencji satelitarnych chromosomów 1, 15 i 17 znakowane odpowiednio: biotyną-11-dUTP, ChromaTide Texas Red-12-dUTP i ChromaTide Oregon Green 488-5-dUTP.

Analiza in situ na chromosomach metafazalnych Ludzkie chromosomy metafazalne hybrydyzowane do sond znakowanych fluorescencyjnie, odpowiadających dwóm blisko sąsiadującym rejonom. Sondy do rejonów 1p34–35 i 1p36 znakowano odpowiednio: Oregon Green 488 i Fluor 594. Chromosomy dodatkowo barwiono DAPI.

Jednoczesne wykrywanie za pomocą FISH trzech genów w preparacie zarodka Drosophila Różnie znakowane sondy cRNA wykrywane za pomocą przeciwciał ze znacznikami fluorescencyjnymi: Oregon Green, HRP–streptawidina/Fluor 568 i Fluor 647.

Drożdżowy system dwuhybrydowy - 1

System dwuhybrydowy - 2

System dwuhybrydowy - 3

Analiza za pomocą drożdżowego systemu dwuhybrydowego oddziaływań AtSWI3, BSH i FCA, białek Arabidopsis (wg. Sarnowski et. al. 2002) Lift filter assay for β-galactosidase activity Lift filter assay for β-galactosidase activity Lift filter assay for β-galactosidase activity AtSWI3B-BD AtSWI3B-AD BSH-BD AtSWI3B-AD AtSWI3A-AD BSH-BD AtSWI3C-AD AtSWI3B-AD AtSWI3B-BD AtSWI3C-AD AtSWI3A-BD AtSWI3C-AD BSH-BD AtSWI3A-BD Negative controls AtSWI3A-AD AtSWI3A-BD BSH-BD AtSWI3C-AD AtSWI3A-BD AtSWI3A-AD FCA-AD AtSWI3A-BD pCL1 FCA-PhD-AD Positive control FCA-PhD-AD AtSWI3A-BD

ATSWI3C BSH ATSWI3A ATSWI3B FCA ATSWI3D AtBRM Farrona et al., 2004 ATSWP73A HD2B NAM PAM1 PAM2 PRL2 AMIDASE Mapa Oddziaływań białek SWI3 w Arabidopsis, wg. Sarnowski et al., niepublikowane

Sarnowski,Rolicka,Ryńska,Koncz, Jerzmanowski - niepublikowane HD2A PIRIN SAHH CobW PRL2 AMIDASE ATSWI3C AtBRM Farrona et. al., 2004 ATSWI3D ATSWP73A HD2B PRL1 BSH AKIN 10/11 ATAF2 ATSWI3A ATSWI3B E3 AAA FCA BIP7 (11-17) RPT3 ATGP4 Proteins studied in Csaba Koncz’ laboratory BIP6 (11-16) JMJC BIP1 (1-57) Core subunits of the SWI/SNF chromatin remodeling complex except for ATPase plus the FCA protein Interactions identified In Csaba Koncz’ laboratory BIP2 (3-32) ARM Interactions verified in pGBT9/pGAD424 system SRC2 RPL12 BIP3 (3-45) Interactions verified in pGBT9/pACT2 system ATPase COP9 ANAC102 BIP5 (1-30) Weak interactions identified in pGBT9/pACT2 system PUX2 BIP4 (3-46) Di19 esterase family protein Proteins identified through the yeast two hybrd screen Interactions identified by other researchers from our laboratory in the pGBT9/pGAD424 system