Identyfikacja dansylowanych aminokwasów metodą cienkowarstwowej chromatografii na płytkach poliamidowych Gawahir Hassan

Wstęp Chromatografia jest techniką służąca do badania składu mieszaniny związków chemicznych. Pierwszy etap to rozdział roztworu na złożu. Drugi etap to identyfikacja składników. W chromatografii cienkowarstwowej (ang. thin layer chromatography) fazą rozdzielczą (złożem) jest sztywna płytka. Można użyć płytek z żelem krzemionkowym – mniejsza rozdzielczość. Natomiast płytki poliamidowe dają dobrą rozdzielczość. Rozdział na płytce następuje gdy eluent dyfunduje w górę płytki. Szybkość poszczególnych składników rozdzielanej mieszaniny jest zależna od oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi obecnymi w analizowanej próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem. Gdy czoło eluenta dotrze do górnej krawędzi płytki rozdział jest zakończony. Identyfikacja składników na płytce jest możliwa poprzez porównanie ze wzorcami. Składniki na płytce powinny być fluoryzujące lub barwne, jeżeli nie to trzeba je wybarwić. W szczególności metoda nadaje się do identyfikacji DNS-aminokwasów.

Miarą rozdziału chromatograficznego jest współczynnik opóźnienia, czyli rozdziału Rf (ang. retardation factor). Definiowany jako iloraz drogi przebytej przez daną substancję x do drogi przebytej przez czoło eluentu y, zgodnie ze wzorem: Rf = 𝒙 𝒚

Jakie aminokwasy identyfikujemy ? Dansylowane aminokwasy wykazują silną, żółtą fluorescencję wynikającą z obecności ugrupowania aromatycznego pochodnej dansylu i ta właściwość jest kluczowa przy ich identyfikacji: DNS-aminokwasy powinny być oglądane pod lampą emitująca promieniowanie ultrafioletowe. Najefektywniejsze wzbudzenie fluorescencji zachodzi w zakresie pasma absorbcyjnego (około 290-380 nm). Kilka minut naświetlania próbki powoduje, że żółta fluorescencja DNS-pochodnych przechodzi w niebieskozieloną.

Wzbudzanie układu przy długości fali λwzbudzenia = 340 nm Widmo absorbcyjne i fluorescencyjne roztworu DNS- glicyny w dioksanie

Identyfikacja dansylowanych aminokwasów może być przeprowadzona za pomocą chromatografii bibułowej lub cienkowarstwowej. Chromatografia bibułowa DNS- aminokwasów, dla której jest znane kilka układów stosowanych rozpuszczalników, jest obecnie bardzo rzadko stosowana i została zastąpiona przez inne metody dające większą rozdzielczość i pewność identyfikacji.

Metoda chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelem krzemionkowym i na płytkach poliamidowych jest nadzwyczaj przydatna do rozdziału i identyfikacji dansylowanych aminokwasów. Zalety: Dobra rozdzielczość prosta i tania aparatura Krótki czas potrzebny do identyfikacji DNS-aminokwasów Wady: niestabilność dansylowanych pochodnych po rozwinięciu chromatogramu w układzie rozpuszczalników (fluorescencja plam zanika przechodząc w żółtopomarańczowe plamy pozbawione fluorescencji) – płytki krzemionkowe * na płytkach poliamidowych chromatografia to niekorzystne zjawisko zachodzi w mniejszym stopniu, jednak płytki te są o wiele droższe od krzemionkowych Jak temu zaradzić ? Β-merkaptoetanol (BME)- kilka kropel dodanych do rozpuszczalników używanych do rozwijania chromatogramu spowoduje zapobieganie utlenianiu aminokwasu, stabilizując tym samym ich strukturę (podobnie jak DDT)

Jak przeprowadzamy chromatografię cienkowarstwową ? W tej metodzie na płytkę poliamidową o wymiarach 5 x 5 cm nakłada się w jednym z rogów niewielką ilość roztworu zawierającego 0,01 nanomola DNS-aminokwasu i rozwija chromatogram w dwóch kierunkach, w dwóch różnych układach rozpuszczalników, można zindentyfikować wtedy: fenyloalanina, leucyna, izoleucyna, prolina, walina, metionina, dilizyna, di-tyrozyna Dokładając trzeci układ, rozwijając chromatogram w tym samym kierunku, możemy zindentyfikować: alaninę, o-tyrozynę, kwas glutaminowy, serynę, histydynę

Wyróżniamy wiele układów chromatograficznych, najczęściej stosowane są: Układ 1: 1,5 % kwas mrówkowy Układ 2: benzen-kwas octowy (v/v= 9:1) Układ 3: octan etylu – kwas octowy-metanol (v/v/v=20:1:1) Układ 4: 0.05 M Na3PO4 w 25 % etanolu Kolejne slajdy przedstawiają poprawny sposób postępowania podczas analizy próbki związku organicznego przy zastosowaniu techniki chromatografii cienkowarstwowej (TLC).

Krok 1 Co należy przygotować ? roztwór analizowanej substancji oraz roztwory wzorcowe, płytki chromatograficzne o odpowiednich rozmiarach, komory chromatograficzne wyłożone bibułą z właściwym eluentem, lampę UV (w przypadku analizy substancji bezbarwnych)

Krok 2 Zaznaczenie ołówkiem linii startu oraz punktów, w których będzie nanoszony roztwór analizowany (X) oraz roztwory wzorcowe (A i B)

UWAGA: Każdy roztwór musi być nanoszony inną, czystą kapilarą! Krok 3 Nanoszenie na zaznaczone uprzednio na płytce miejsca analizowanych roztworów przy użyciu wąskiej kapilary. l UWAGA: Każdy roztwór musi być nanoszony inną, czystą kapilarą!

Krok 4 Umieszczenie przygotowanej płytki w komorze chromatograficznej: UWAGI: Eluent w komorze nie może sięgać do dolnej krawędzi plamek! Raz wstawionej płytki nie wolno już poprawiać! Płytka powinna stać prawie pionowo, lecz jej boczne krawędzie nie mogą dotykać ani bibuły, ani ścianek naczynia!

UWAGA: Podczas rozwijania chromatogramu komory nie wolno poruszać! Krok 5 Rozwijanie chromatogramu do czasu, aż czoło rozpuszczalnika znajdzie się w odległości 3 – 5 mm od górnej krawędzi płytki. UWAGA: Podczas rozwijania chromatogramu komory nie wolno poruszać!

Krok 6 Wyjęcie płytki z komory, zaznaczenie miejsca, do którego doszło czoło rozpuszczalnika (tzw. linii mety) i wysuszenie płytki. Obliczanie Rf dla plamki wzorcu A: Rf (A) = a / d Rf (A) = 38,5 mm / 51,0 mm Rf (A) = ok. 0,75 Krok 7 Obejrzenie płytki w świetle UV, zaznaczenie wszystkich plamek, obliczenie dla nich współczynnika Rf i interpretacja chromatogramu.

BIBLIOGRAFIA Czarny, B. Kawałek, A. Kolasa, P. Milart, B. Rys, J. Wilamowski „Ćwiczenia laboratoryjne z chemii organicznej, zasady bezpieczeństwa, aparatura i techniki laboratoryjne”, Wydawnictwo Adamantan, Warszawa 2008 file:///C:/Users/User/Downloads/Gray_Methods_in_Enzymology_25.pdf file:///C:/Users/User/Downloads/cwiczenie_6.pdf Zdjęcia zaadaptowano z : https://pl.wikipedia.org/wiki/TLC_(chemia) „Ćwiczenia laboratoryjne z chemii organicznej, zasady bezpieczeństwa, aparatura i techniki laboratoryjne, wersja PDF