Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

NOWE METODY DIAGNOSTYKI GRUŹLICY Hanna Grubek-Jaworska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "NOWE METODY DIAGNOSTYKI GRUŹLICY Hanna Grubek-Jaworska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie."— Zapis prezentacji:

1 NOWE METODY DIAGNOSTYKI GRUŹLICY Hanna Grubek-Jaworska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie III Konferencja Naukowo-Szkoleniowa „Zakażenia Układu Oddechowego” października 2006

2 o Około 80% zachorowań na gruźlicę wykrywa się z objawów o Jedynym, niepodważalnym potwierdzeniem wstępnego rozpoznania choroby jest uzyskanie dodatnich wyników diagnostyki mikrobiologicznej. o W 2005 r. wśród nowo zarejestrowanych (9 280) jedynie u potwierdzono gruźlicę bakteriologicznie (58,3 %), wśród chorych na gruźlicę płuc 61,2 %

3 Specyfika laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy wiąże się z: o niskim tempem namnażania się prątków na pożywkach o koniecznością stosowania wielu technik wykrywania zakażenia mikroskopia techniki hodowlane przyspieszające wzrost techniki molekularne

4 Prawidłowa laboratoryjna diagnostyka gruźlicy obejmuje o bakterioskopię o wyhodowanie prątków o określenie gatunku wyhodowanych prątków o określenie lekowrażliwości

5 o Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki gruźlicy jest spełnienie powyższych wymogów diagnostycznych w maksymalnie krótkim czasie o Docelowo całość diagnostyki nie powinna przekraczać dni

6 Laboratoria prątka gruźlicy I Rzędu: mikroskopia II Rzędu: hodowla identyfikacja M.tuberculosis complex ocena lekowrażliwości na INH,RMP,SM,EMB III Rzędu: identyfikacja ważniejszych gatunków prątków testy lekowrażliwości dla leków drugiej linii testy lekowrażliwości dla prątków atypowych

7 o bakterioskopia uzupełniona o metody molekularne o wyhodowanie prątków pożywka L-J pożywki płynne z różnymi systemami detekcji o określenie gatunku wyhodowanych prątków konwencjonalne metody bioch.-mikrobiologiczne metody molekularne analiza kwasów mikolowych techniką HPLC o określenie lekowrażliwości metody fenotypowe metody molekularne? Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka gruźlicy

8 barwienie metodą Ziehl-Neelsena mikroskopia w świetle widzialnym Mycobacterium sp. barwienie auraminą mikroskopia w świetle UV

9 O 1-2 / 300 pól widzenia 1-9 / 100 pól widzenia 1-9 / 10 pól widzenia 1-9 / 1 pole widzenia > 9 / 1 pole widzenia Prawdopodobnie negatywny (nie wystarczająca liczba prątków dla wykrycia w bekterioskopii) Nie uznawany za pozytywny, konieczność badania dalszych próbek + (sporadyczne) ++ (nieliczne) +++ (średnio liczna) ++++ (liczne) */ przy powiększeniu 800 x x ( obecność prątków wynik

10 B a k t e r i o s k o p i a B a k t e r i o s k o p i a (+) (-) Wykrywa chorych silnie prątkujących Czas wykonania około 3 godzin Niska cena badania Nie różnicuje prątków żywych i martwych Nie różnicuje gatunku prątków Czułość w wykrywaniu gruźlicy w plwocinie około 30 %

11 AFB (+) M.Tuberculosis % NTM (MOTT) 60 – 70%

12 TB n = 82 (38%) NTM n = 135 (62%) mykobakteriozy n = 9 (7%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 126 (93%) potwierdenie TB testem MTB wykluczenie TB testem MTB Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii ( ) Chorzy - mikroskopia dodatnia (n = 217)

13 Przy wynikach AFB(+) zalecanym postępowaniem jest wykonanie (możliwie z tej samej próbki klinicznej) badania techniką molekularną, która pozwala zidentyfikować genom prątków gruźlicy

14 o Amplicor (MTB) test (Roche Molecular System,Somerville, New Jersey) rozpoznaje M.tuberculosis complex PCR (6 – 8 godz) o Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen-Probe Inc. San Diego, Ca) rozpoznaje M.tuberculosis complex, M.avium complex, M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.gordonae, rRNA (2 – 3 godz) o BDProbe Tec ET Mycobacterium tuberculosis complex Direct Detection Assay (SDA - Strand Displacement Amplification) (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.) rozpoznaje M.tuberculosis complex, M.avium complex oraz M.kansasii SDA (1,5 godz) Systemy molekularne dopuszczone do rutynowej diagnostyki gruźlicy

15 Metody biologii molekularnej (+) (-) Czas wykonania badania – kilka / kilkanaście godzin Czułość wykrywania gruźlicy około % Swoistość % Wykrywanie zakażeń w bardzo wczesnej fazie Stosunkowo wysoka cena badania Szkolenie, aparatura Możliwość identyfikacji jedynie 5 gatunków prątków: M.tbc complex, M.avium, M.intracellulare, M.konsasii, M.gordonae Jedynie metodą molekularną można w czasie kilku godzin wykryć obecność prątków gruźlicy bezpośrednio w materiale klinicznym

16 Próbka kliniczna Dekontaminacja Zagęszczanie Izolacja DNA PCR Wykrycie produktów reakcji Amplicor MTB PCR (Roche)

17 o W zakresie diagnostyki gruźlicy, czułość i swoistość wymienionycvh systemów molekularnych jest porównywalna o W rutynowej diagnostyce gruźlicy nie należy stosować metod ”domowych” o Próbki kliniczne mogą być przesyłane pocztą (do 5 dni) bez utraty wartości diagnostycznej w zakresie zakażeń prątkowych

18 próbka mikroskopowo dodatnia amplifikacja pozytywna 1x amplifikacja negatywna 2 x inhibicja TB obecna brak mykobakterioza ? badanie następnych próbek REKOMENDACJA CDC

19 próbka mikroskopowo ujemna amplifikacja negatywna 2 x amplifikacja pozytywna 2 x amplifikacja zahamowana TB ? nie TB

20 metoda i wynik liczba chorych AFB (+) hodowla (+) 62 AFB (-) hodowla (+) 51 AFB (+) hodowla (-) 20 * AFB (-) hodowla (-) 9 * ogółem 142 Chorzy na gruźlicę ( ) * dodatni test molekularny (MTB) w próbkach 9 / 51 chorych wynik testu MTD był ujemny Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie ( ) czułość mikroskopii 58% czułość hodowli 79%

21 o radiometryczny Bactec 460 Tb (Becton Dickinson) (możliwość różnicowania M.Tbc / NTM) o kolorymetryczny system - MB Bac T (Organon Teknika Corporation) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze, osobne podłoża dla próbek krwawych) o system fluorymetryczny MGIT (Mycobacterial Growth Indicatory Tube) (Beckton Dickinson) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze) Systemy detekcji wzrostu prątków na pożywkach płynnych

22 wyhodowane prątki M.Tuberculosis % NTM (MOTT) 60 – 70%

23 TB n = 113 (36%) NTM n = 199 (64%) mykobakteriozy n = 22 (11%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 170 (89%) potwierdzenie TB testem MTB lub techniką HPLC wykluczenie TB testem MTB, typowanie gatunku HPLC M.xenopin = 57 M.kansasii n = 42 M.gordonae n = 33 M.avium n =10 M.abscseus n = 9 M.fortuitum n = 8 M.flavescens n = 1 M.scrofulaceum n = 1 M.neoaurum n = 1 M.nonchromogenicum n = 1 unidentified sp. n = 9 Chorzy – hodowle dodatnie (n = 312) ( ) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii)

24 LMW HMW HPLC (high pressure liquid chromatography) Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa Analiza składu kwasów mykolowych: 1.Hydroliza 2.Ekstrakcja chloroformem 3.Przekształcenie kwasów mykolowych w bromofenacylowe pochodne 4.Rozdział na kolumnie w fazie odwróconej 5.Wzór elucyjny badanej próby 6.Analiza porównawcza z biblioteką zgromadzonych wzorów elucyjnych szczepów wzoprcowych z ATCC M.tuberculosis M.avium M.interjectum

25 Porównanie czułości i czasochłonności metod laboratoryjnych w wykrywaniu gruźlicy metody molekularne 70 – 90 1 dzień hodowla 70 kilka dni - 8 tyg mikroskopia 33 – godz czułość czasochłonność (%)

26 próbka kliniczna (po wstępnym opracowaniu) hodowla ujemnadodatnia metoda molekularna Tbc nie Tbc bakterioskopia  bk - bk+ metody molekularne MAC M.kansasii M.tuberculosis lub HPLC lekooporność met. hodowlane lub met. molekularne kilkadziesiąt gatunków prątków M.tuberculosis wynik 24 h kilkanaście dni do 10 tyg. kilka godzin do 40 dni test niacynowy

27 Ujemne wyniki badań laboratoryjnych nie wykluczają rozwoju choroby bowiem żadna z metod laboratoryjnych nie charakteryzuje się 100% czułością

28 Najczęstsze błędy laboratoryjne i interpretacyjne lub zaniechania w mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy

29 Jednoznaczna interpretacja mikroskopii AFB (+) jako gruźlicy, AFB (+) może wskazywać o gruźlicę o saprofit środowiskowy – (NTM / MOTT) o mykobakterioza o w przypadku materiałów bronchoskopowych zanieczyszczenie instrumentarium I

30 Brak typowania do gatunku wyrośniętych szczepów prątków - poprzestanie na wykonaniu testu niacynowego różnicujacego jedynie M.tbc oraz MOTT nie pozwala to na: o diagnozowanie mykobakterioz o wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń prątkami środowiskowymi II

31 III Zaniechanie wzywania na dodatkowe badania mikrobiologiczne chorych ze wskazaniami klinicznymi, u których wyhodowano prątki niegruźlicze Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy

32 Brak systematycznej oceny mikrobiologicznej czystości sprzętu endoskopowego IV

33 Diagnostyka uśpionych zakażeń M.tbc Latent Tuberculosis Infection - LTBI Immunologiczna diagnostyka zakażenia M.tuberculosis w warunkach in vitro

34 czas nasilenie odpowiedzi cell mediated immunity replikacja prątków przeciwciała zakażenie Odpowiedź na zakażenie M.tuberculosis choroba L a t e n t TB I n f e c t i o n

35 Zjawisko, które było podstawą współcześnie stosowanego testu tuberkulinowego opisał w 1890 roku Robert Koch, kontynuatorami jego pracy byli Charles Mantoux i Clemens von Pirquet skórny test tuberkulinowy (tuberculin skin test -TST) stosowany jest od 1907 roku.

36 komórka prezentująca antygen komórka pamięci test skórny krew - test in vitro TNF-  IL- 8 IFN-γ pomiar testu tuberkulinowego TNF-  IL- 8 IFN-γ pomiar produkcji IFN-γ stymulacja

37 Czynniki negatywizujące TST: o Zależne od osoby badanej infekcje (wirusowe, bakteryjne, grzybicze) zaburzenia metaboliczne niedożywienie choroby narządów limfatycznych(np..białaczka, sarkoidoza) leki (glikokortykoidy, leki immunosupresyjne) wiek o Zależne od preparatu tuberkulinowego nieodpowieednie rozcieńczenie chemiczna denaturacja adsorpcja na szkle kontaminacja o Zła technika szczepienia o Zła technika odczytu

38 ekspozycja na M.tbc brak dowodów zakażenia 5 % zakażenie 95 % zakażanie uśpione 95 % gruźlica 5% wg E.Tortoli 2005 nie dochodzi do rozwoju choroby 90% gruźlica %

39 o Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat stworzyły test alternatywny dla skórnego testu tuberkulinowego o Jest to test in vitro nowej generacji mierzący poziom odporności komórkowej o Podstawą testu jest oddziaływanie na komórki w warunkach in vitro wysoko swoistych dla M.tuberculosis antygenów ESAT-6 oraz CP-10 stymulujących wydzielanie IFN-gamma

40 NTM Antygen M abscessus-- M avium-- M branderi-- M celatum-- M chelonae-- M fortuitum-- M gordonae-- M intracellulare-- M kansasii++ M malmoense-- M marinum++ M genavense-- M scrofulaceum-- M smegmatis-- M szulgai++ M terrae-- M vaccae-- M xenopi-- Antygen ESAT-6 CFP-10 ESAT-6 M tuberculosis ++ BCG moreau tokyo-- danish-- glaxo-- montreal ESAT-6 - early secretory antigenic target 6 CP-10 - culture filtrate protein niskocząsteczkowe białka swoiste dla M.tuberculosis pasteur CFP-10

41 QuantiFERON - TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S. Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (Latent Tuberculosis Infection -LTBI) CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)

42 Quantiferon metoda probówkowa krew inkubacja h w 37°C badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny kolor kolor kontrola ESAT6 + CFP10 mitogen ujemna wirowanie odczytanie stężenia z krzywej standardowej odczytanie stężenia z krzywej standardowej DO 450nm IFN-  IU/ml 1 2

43 I etap – inkubacja leukocytów z antygenem, zebranie nadsączu ELISA – IFN-γ krew + antygen kontrole: krew bez Ag krew + mitogen Inkubacja w godz. wirowanie,2000g przez 5-10 min pobranie 200 μl plazmy konjugat + badana plazma lub standard inkubacja 120 min płukanie, dodanie substratu dodanie roztworu stopującego odczytanie stężenia z krzywej standard.

44 pobranie krwi pobranie krwi ESAT-6CFP-10 mitogen krew + antygeny inkubacja 24h, wydzielenie IFN-γ inkubacja 24h, wydzielenie IFN-γ ‘sandwich’ ELISA, (incubacja 120 min) dodanie substratu, reakcja barwna dodanie substratu, reakcja barwna KOLOR odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej Quantiferon – metoda płytkowa K DO 450nm IFN-  IU/ml

45 miogen – K ESAT 6 – K i / lub CFP 10 – K wynikinterpretacja  0,5  0,35 pozytywnyzakażenie prawdopodobne < 0,5  0,35 pozytywnyzakażenie prawdopodobne  0,5 < 0,35negatywnyzakażenie nieprawdopodobne < 0,5 < 0,35nieokreślonybrak wyniku QuantiFERON  TB Gold – interpretacja wyników IU IFN- γ /ml

46 pobranie krwi pobranie krwi ESAT-6CFP-10 mitogen inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ inkubacja 24 h w 37 o C inkubacja 24 h w 37 o C ‘sandwich’ ELISA, (Inkubacja 120 min) ocena liczby barwnych plamek ocena liczby barwnych plamek kontrola separacja leukocytów jednojądrzastych separacja leukocytów jednojądrzastych kOLOR T SPOT- TB  assay metoda ocena liczby komórek syntetyzujących IFN-γ

47 T SPOT- TB  assay 1 2 Zawiesinę leukocytów krwi ( /ml) nawarstwia się na płytkę opłaszczoną przeciwciałem anty IFN-γ, dodaje antygeny swoiste dla TB  uwalniany IFN-γ wychwytywany jest przez przeciwciała Po odpłukaniu dodaje się wtórne przeciwciało znakowane enzymem, a nstępnie substrat, co wizualizuje test  plamki barwne (1 plamka = 1 komórka T)

48 Jeżeli w kontroli negatywnej.>10 lub kontroli pozytywnej <20 test nie może być interpretowany

49 Korelacja IFN-γ / Mantoux IFN- γ Mantoux czułość89.0% (105/118) 65.7% (50/76; 5 mm) swoistość98.2% (213/217) 35.4% (73/113; 10 mm) Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004

50 FIG. 1. Individual IFN- response to PPD and either of the RD1 antigens ESAT-6 or CFP-10 (E6/C10) (for each patient the highest IFN- responses) are shown. In the left panel, the responses of the TB suspect population (n = 73); and in the right panel, the responses for the healthy control population (n = 39). The cutoff value for a positive response was set at 0.35 IU/ml for ESAT-6 and CFP-10 and arbitrarily at 1.5 IU/ml for PPD. The dotted lines represent the cutoff for the specific antigens and PPD. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, April 2005, p , Vol. 12, No. 4

51 Figure 1. Dot plot of individual responses to CFP-10 and ESAT-6 for 118 culture-positive patients with tuberculosis (TB) (a), 213 subjects with a low risk for TB exposure (b), and 33 TB suspects whose TB status could not be determined, as Mycobacterium tuberculosis could not be cultured (c). *For "ESAT/CFP" the data for the antigen (ESAT-6 or CFP-10) giving the highest response is shown. The dashed line represents the cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp , (2004) cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ

52 Ograniczenia metodyczne Quantiferonu- TB Gold (błędy techniczne) oużycie innych antykoagulantów niż heparyna onieodpowiedni transport krwi ozbyt wysoke stężenie IFN-gamma we krwi oczas > 12 godzin po pobrania krwi

53 Ograniczenia merytoryczne Quantiferonu- TB Gold otest nie powinien być stosowany w przypadkach zaniżonej liczby limfocytów ow przypadkach upośledzonej reaktywności immunologicznej (HIV, AIDS, transplantacje, immunosupresja polekowa) o u kobiet w ciąży o u osób poniżej 17 r.ż.

54 kierunki badań: oQFT-G u dzieci, szczególnie <5 r.ż. oQFT-G u osób z zaburzeniami układu odpornościowego o czułość testuw gruźlicy pozapłucnej oprzypadki TB w następstwie wykluczenia lub potwierdzenia LTBI przez QFT-G oczas po ekspozycji na M.tbc niezbędny dla pozytywizacji QFT-G oanaliza ekonomiczna stosowania TST vs QFT-G ozmiany QFT-G u chorych leczonych z powodu LTBI oraz TB – monitorowanie terapii

55 W diagnostyce rutynowej wiele spośród wspomnianych nowszych technik mogą stosować jedynie wybrane laboratoria Techniki te stanowią w wielu przypadkach jedynie uzupełnienie metod konwencjonalnych Zaleca się łączenie nowych technik z diagnostyką tradycyjną

56 dziękuję za uwagę


Pobierz ppt "NOWE METODY DIAGNOSTYKI GRUŹLICY Hanna Grubek-Jaworska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie."

Podobne prezentacje


Reklamy Google