Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 3: Badania strukturalne oligonukleotydów.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 3: Badania strukturalne oligonukleotydów."— Zapis prezentacji:

1 Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 3: Badania strukturalne oligonukleotydów

2 Budowa kwasów nukleinowych – schemat ogólny 5' cukier 3'fosforan5' cukier 3'fosforan5' cukier 3' zasada azotowa zasada azotowa zasada azotowa 5' koniec3' koniec

3 Budowa kwasów nukleinowych część cukrowa – struktury zasada 2'-deoksyryboza ryboza

4 Budowa kwasów nukleinowych część cukrowa – przesunięcia chemiczne 1 H [ppm] DNA RNA G A C T G A C U H1' H2 ' H2 '' H3 ' H4 ' H5 ' H5 '' C [ppm] DNA RNA C1 ' C2 ' C3 ' C4 ' C5 '

5 cytozyna tymina uracyl adenina guanina Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – struktury A, G – puryny C, T(U) - pirymidyny

6 zasada niewymienialnewymienialne T H(6) NH (3) CH 3 (5) U H(5) NH(3) H(6) C H(5) NH 2 (4) / H(6) A H(2) NH 2 (6) 5-6 / 7-8 H(8) G H(2) NH(1) H(8) NH 2 (2) 5-6 / 8-9 Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 1 H

7 Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 13 C i 15 N DNA RNA G A C T G A C U N C N C C C N C N NH

8 zasada azotowa imina 1 J(NH) 90 1 J(CH) J(C8N9) J(C8N7) 10 1 J(C6N1) 13 cukier 1 J(C1H1) J( C2H2) J( C3H3) J( C4H4) J( C5H5) cukier – zasada 1 J(C1N1) J(C1N9) Budowa kwasów nukleinowych sprzężenia spinowe

9 Komplet sprzężeń 1 J w guaninie K. Ruszczyńska et al., Biophysical Journal, 85, 1450 (2003). G calc GTP exp C8-H N2-H C4-C C4-N C5-C C5-N C6-N C8-N9-5.9nakład C8-N7-8.7nakład

10 Struktura drugorzędowa kwasów nukleinowych

11 Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych dwuniciowe helisy B A Z B: typowa dla dwuniciowego DNA w komórkach A: dwuniciowy RNA i DNA+RNA Z: obszary DNA posiadające naprzemiennie puryny i pirymidyny; np. 5'-CGCGATCG-3'

12 Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych trypleksy tetrapleksy

13 Motywy drugorzędowe struktury RNA Rodzaje RNA rybosomalny (rRNA) matrycowy (mRNA) transportujący (tRNA) niekodujący (ncRNA) Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych Struktury RNA

14 Ogólna strategia wyznaczania struktur białek 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego białka lub kompleksu białkowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów. Przypomnienie

15 Ogólna strategia wyznaczania struktur kwasów nukleinowych 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego kwasu nukleinowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

16 RNA - 34 nt; typowe widmo 1 H NMR NH H2,H6,H8,NH 2 H5,H1' H2',H3',H4',H5',H5''

17 DNA - 20 nt; typowe widmo 1 H NMR różnice względem RNA: H2',H2'' oddzielone; CH3(T)

18 Przypisanie sygnałów: RNA - korelacje H1'/H2'

19 20-nt RNA, naturalna zawartość 13 C, 30 o C Przypisanie sygnałów: RNA – korelacje H1'/C1'

20 Przypisanie sygnałów: RNA –korelacje H2'/C2'…H5'H5''/C5'

21 Przypisanie sygnałów: DNA – korelacje H2/H7 w tyminach

22 Przypisanie sygnałów: korelacje H5/H6 w cytozynach i uracylach

23 Przypisanie sygnałów: korelacje C5/H5 w cytozynach i uracylach

24 Przypisania sekwencyjne: korelacje 1 H/ 31 P

25 Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H5/H1' G G A U U A C U 5 U G A C A AA G U C U C C C C A G U A G G G G 2D NOESY 800 MHz, m =300ms, 100% 2 H 2 O, 25°C H1' / H5 (ppm) H2 / H6 / H8 (ppm) C G G1 C Å C26 H5-H6

26 20 nt RNA, NOESY Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H6,H8/H1'

27 Przypisania sekwencyjne: DNA – korelacje H6,H8/H1' 27 nt DNA, NOESY

28 Inne możliwe przypisania sekwencyjne: DNA i RNA H6,H8/H2' H6,H8/H2'' 2H6,H8/H3'H6,H8/H4'

29 U20G21 G19 A22 G18 – C23 G17 – C24 C16 – G25 A15 – U26 U13 C14 – G27 C12 C11 U10 U9 A8 C7 – G28 A6 – U29 G5 – C30 G4 – C31 A3 – U32 G2 – C33 G1 – C34 Przypisania sekwencyjne: korelacje protonów iminowych (tylko G i T/U)

30 3D HCCH-COSY 3D HCCH-TOCSY 3D H b C b N b H6-C6-N1 H8-C8-N9 Przypisania w oligonukleotydach znakowanych cukry zasady

31 3D HCN lub 2D H(C)N H1'-C1' -N1/N9 Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada

32 2D H(C)N

33 1h J NH 2 – 4 Hz 6 – 7 Hz 2 J NN 2D H(N)N-COSY Więzy wiązań wodorowych – parowanie zasad

34 800 MHz, 95% H 2 O, 5°C 1 H (ppm) 1 H (ppm) 15 N (ppm) N1 N3N3 N3N3 2D NOESY 800 MhHz, 95% H 2 O, 5°C 1 H (ppm) 2D HNN-COSY 10 Parowanie zasad

35 Powody, dla których dotychczas wyznaczono niewiele struktur oligonukleotydów DNA mało interesujące – podwójna helisa, parowanieW-C RNA – interesujące, ale znacznie trudniejsze: widma trudniejsze w interpretacji – degeneracja przesunięć chemicznych w cukrach, trudne w otrzymywaniu: trzeba dysponować znakowanymi trójfosforanami rybonukleotydów, matrycą DNA i polimerazą RNA; niska wydajność, bardzo trudne w utrzymaniu: rozkład powodują ślady metali, nukleazy, autoliza i znikają


Pobierz ppt "Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 3: Badania strukturalne oligonukleotydów."

Podobne prezentacje


Reklamy Google