Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Dr Stanisława Koronkiewicz Bio- i chemiluminescencja Od robaczków świętojańskich do laboratoriów XXI wieku Olsztyn, 3.III.2006.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Dr Stanisława Koronkiewicz Bio- i chemiluminescencja Od robaczków świętojańskich do laboratoriów XXI wieku Olsztyn, 3.III.2006."— Zapis prezentacji:

1 Dr Stanisława Koronkiewicz Bio- i chemiluminescencja Od robaczków świętojańskich do laboratoriów XXI wieku Olsztyn, 3.III.2006.

2 Luminescencja – zimne świecenie Świecenie ciał wywołane innymi czynnikami niż podniesienie temperatury źródła promieniowania Rys. Podział zjawisk luminescencyjnych w zależności od czynnika wzbudzającego, który podano w nawiasach.

3 Chemiluminescencja – emisja promieniowania widzialnego towarzysząca reakcjom chemicznym przebiegającym w temperaturze pokojowej, w której nie należałoby normalnie oczekiwać świecenia. Energia reakcji chemicznych, która jest zazwyczaj wydzielana w postaci ciepła, w nielicznych przypadkach jest zużywana na wzbudzenie układu elektronowego cząsteczek produktu reakcji i dalej może być wydzielana w postaci kwantu światła: S 1 + S 2 P 1 * + P 2 P 1 + P 2 + h S1, S2 – substraty reakcji, P1* - produkt reakcji w stanie wzbudzonym, P2 – produkt reakcji w stanie podstawowym, h - kwant emitowanego światła. Wydajność kwantowa chemiluminescencji jest równa 1 (czyli 100 %), gdy zajściu jednego aktu reakcji chemicznej towarzyszy emisja jednego kwantu światła.

4 Chemiluminescencja przebiegająca w organizmach żywych jest nazywana bioluminescencją

5 Bioluminescencja Chrząszcze- enzymatyczne utlenianie lucyferyny katalizowane lucyferazą Bakterie- enzymatyczne utlenianie prostych aldehydów alifatycznych. W reakcji bierze udział flawinomononukleotyd (FMNH 2 ) oraz ATP. Wydajność kwantowa bioluminescencji – kilkadziesiąt % !!!

6 Chemiluminescencja Wydajność kwantowa intensywnej chemiluminescencji: od 1do 30% (Lee 1997 ) Najwydajniejsze reakcje chemiluminescencji: 1. świecenie luminolu w rozpuszczalnikach organicznych (DMSO), 2. utlenianie lucygeniny, 3. utlenianie dwukrzemku wapnia CaSi2, 4. utlenianie szczawianów organicznych w obecności przenośników energii.

7 Do kolby stożkowej o pojemności 750 ml wsypujemy 50 g stałego KOH i wlewamy 20 ml dwumetylosulfotlenku ( (CH3)2SO – DMSO ), a następnie dodajemy ok. 10 mg stałego luminolu. Zawartość kolby intensywnie wstrząsamy. Po 2 – 3 minutach rozpoczyna się emisja światła. Jasność świecenia jest tak duża, że pozwala na czytanie druku w ciemności. Czas świecenia wynosi ok. 30 minut. Zwiększenie ilości luminolu pogarsza emisję światła, natomiast wstępne napełnienie kolby tlenem podwyższa jaskrawość świecenia. Doświadczenie to można przeprowadzić także stosując zamiast KOH NaOH oraz dwumetyloformamidu (HCON(CH3)2 – DMF ) zamiast dwumetylosulfotlenku, jednak daje to nieco gorszy wynik. Informacje na temat luminescencji luminolu można znaleźć: T.Pluciński. "Doświadczenia chemiczne". Wyd. Adamantan, Warszawa Doświadczenie: LUMINOL pK a1 =6.00 pK a2 =13.00

8 Chemiluminescencja luminolu związana jest z utlenianiem luminolu z środowisku alkalicznym w obecności aktywatorów Warunki reakcji: środowisko alkaliczne, obecność utleniacza (np. woda utleniona, ClO -, anoda elektrolizera), obecność aktywatora (np. jony Fe(III), Cu(II)), Cr(III)... ) W roztworze wodnym wydajność kwantowa świecenia nie przekracza 0,1%. W niektórych polarnych rozpuszczalnikach organicznych (DMSO, DMF), wydajność kwantowa może być nawet 10 razy większa. Może zachodzić pod wpływem tlenu powietrza, bez obecności aktywatora.

9 Reakcję luminescencji luminolu można wykorzystać do oznaczania: różnego rodzaju utleniaczy (oznaczenia bezpośrednie), substancji, które w reakcjach chemicznych jako jeden z produktów dają utleniacz, np. nadtlenek wodoru. Wykorzystuje się to m.in. w oznaczeniach glukozy z wykorzystaniem oksydazy glukozowej (oznaczenia pośrednie). aktywatorów: jonów metali, np.: Co(II), Fe(III), Cu(II)), Cr(III)...

10 AnalitRodzaj reakcji chemiluminescencyjnejMatryca próbkiLimit detekcji Literatura Substancje nieorganiczne Cr(III)Luminol – H 2 O 2 Próbki żywności; woda destylowana, pitna, mineralna 0.01 ppb E SCOBAR i inni 1993 Fe(III)Luminol – wodny roztwór amoniaku - H 2 O 2 Woda morska0.003 ppb O BATA i inni 1993 H2O2H2O2 Luminol z sensybilizatorem (eozyna Y-uranina) Woda kranowa 3, ppb I SHII i S HIRAI 1992 CN - Czujnik wykorzystujący luminol unieruchomiony na wypełnieniu anionowymiennej kolumny Ścieki przemysłowe1 ppb L U i inni 1995 NO 2 - Redukcja do NO; chemiluminescencja w fazie gazowej w reakcji z ozonem Ekstrakty żywności, ludzka ślina 0.04 ppb D UNHAM i inni 1095 Substancje organiczne etanolEnzymatyczna produkcja H 2 O 2; reakcja luminolu z haksacyjanożelazianem(III) potasu wino10 -6 mol/l X IE i inni 1992 Przykłady oznaczeń chemiluminescencyjnych

11 Problemy z chemiluminescencją: 1. Brak selektywności 2. Zależność sygnału od takich czynników jak: temperatura, rodzaj rozpuszczalnika, siła jonowa roztworu i jego pH. Polepszanie selektywności: Połączenie CL z jakąś techniką rozdziału (np. HPLC, elektroforeza kapilarna), Zastosowanie reakcji elektrochemicznych Wykorzystanie reakcji enzymatycznych lub immunologicznych (oznaczenia pośrednie)

12 Biosensory enzymatyczne Dlaczego? Bardzo duża selektywność reakcji przebiegających w organizmach żywych (reakcje enzymatyczne, reakcje immunologiczne) Jak? Nadtlenek wodoru powstający w wysokospecyficznej reakcji enzymatycznej jest poddawany czułej detekcji chemiluminescencyjnej.

13 Pomiar natężenia chemiluminescencyjnych można wykorzystać jako metodę detekcji w: wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), elektroforezie kapilarnej (CE), technikach przepływowych (FIA, przepływowa analiza multikomutacyjna lub sekwencyjna). Metody te wymagają unieruchomienia jednego z substratów reakcji. Można to zrobić wykorzystują w tym celu np. kolumny jonowymienne lub adsorbując odpowiednie substancje na powierzchni biosensora. Czujniki enzymatyczne: (Kalinowski 2004) Jednym ze sposobów unieruchomienia różnego rodzaju enzymów na powierzchni metalu jest wykorzystanie kompleksów biotyny (witaminy H) z awidyną lub streptawidyną. W handlu jest dostępnych wiele biotynylowanych substancji, np. enzymy, lipidy, znaczniki fluorescencyjne, DNA, RNA… Biotynylowane cząsteczki można łatwo adsorbować na powierzchniach pokrytych awidyną lub streptawidyną.

14 Biotyna (witamina H, witamina B 7 ) Biotynylowane fosfolipidy Substancje stosowane do osadzania enzymu na stałym podłożu Awidyna, Streptawidyna – białka silnie wiążące się z biotyną

15 a- awidyna osadzona na stałym hydrofobowym podłożu, b- awidyna połączona z podłożem za pomocą biotyny, c- na Au osadzona warstwa merkaptanu, na tym monowarstwa fosfolipidowa zawierająca biotynylowane fosfolipidy Tworzenie aktywnej powierzchni biosensorów

16 FIA z detekcją chemiluminescencyjną Jedna z najbardziej uniwersalnych i prostych metod automatyzacji analiz chemicznych Charakteryzuje się dobrą precyzją i szybkością odpowiedzi Pozwala na znaczne zmniejszenie zużycia odczynników Typowy system do FIA (flow inhjection analysis) jest łatwy w obsłudze Automatyzacja analiz PP- pompa perystaltyczna, ZW- zawór wstrzykowy, S- spirala (reakcyjna lub emisyjna, PMT- fotopowielacz, A- miernik fotoprądu

17 Przepływowa amaliza multikomutacyjna MCFA – multicommutation flow analysis Technika automatyzacji analizy przepływowej opierająca się na zastosowaniu najczęściej trójdrożnych zaworów elektromagnetycznych sprzężonych ze sobą w sieć odpowiednio zaprojektowanych połączeń. Trójdrożne zawory elektromagnetyczne mogą pozostawać w dwóch pozycjach umożliwiających przepływ cieczy w dwóch różnych kierunkach. Elektroniczna kontrola czasu trwania impulsu przełączającego zawór pozwala na uzyskanie bardzo powtarzalnych wyników, przy objętościach próbek rzędu mikrolitrów. Dzięki multikomutacyjnemu mieszaniu reagentów uniknąć można nadmiernego zużycia odczynników.

18 Zestaw do multikomutacyjnej analizy przepływowej z detekcją chemiluminescencyjną V1, V2 – trójdrożne zawory elektromagnetyczne P-pompa perystaltyczna, FC-naczynko przepływowe do pomiarów luminescencji, PMT-fotopowielacz, KSP-zestaw pomiarowy firmy KSP, PC-komputer.

19 Zestaw do przepływowej analizy multikomutacyjnej pracujący w Katedrze Chemii UWM

20 Rys. Okno edycyjne programu stosowanego do sterowania pompą perystaltyczną i zaworami elektromagnetyczne oraz do rejestracji natężenia fotoprądu chemiluminescencji.

21 Źródło światła: Reakcja utleniania szczawianów organicznych rozcieńczonym roztworem bezwodnego nadtlenku wodoru w mieszaninie ftalanu metylu i alkoholu tert-butylowego, katalizowana salicylanem sodu. Czas świecenia takiej latarki wonosi od 5 min do 12 godzin. Chemiczne oświetlacze "Cyalume Zastosowanie: ratownictwo, speleologia, turystyka, policja, wojsko. Chemiczna latarka jest odporna na stłuczenie, czy zalanie woda, ale nie da się jej wyłączyć… Przykłady komercyjnych zastosowań chemiluminescencji

22

23 Literatura Lee Won-Yong, (1997) Tris (2,2-bipyridyl)rutenium(II) electrogenerated chemiluminescence in analytical science. Microchim. Acta, 127, Fahnrich, K.A., Pravda M., Guilbault G.G., (2001) Recent applications of electrogenated Chemiluminescence in chemical analysis. Talanta, 54, Roda A., pasini P., Mirasoli M., Michelini E., Guardigli M., (2004) Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence. Trends Biotechnol., 22, Kalinowski S., Elektrochemia membran lipidowych. Od błon komórkowych do biosensorów. Wydawnictwo UWM, Olsztyn T.Pluciński. "Doświadczenia chemiczne". Wyd. Adamantan, Warszawa


Pobierz ppt "Dr Stanisława Koronkiewicz Bio- i chemiluminescencja Od robaczków świętojańskich do laboratoriów XXI wieku Olsztyn, 3.III.2006."

Podobne prezentacje


Reklamy Google