Marta Twardowska, Piotr Masojć

Prezentacja na temat: "Marta Twardowska, Piotr Masojć"— Zapis prezentacji:

1 Marta Twardowska, Piotr Masojć
Ocena efektywności selekcji markerami molekularnymi RAPD w kierunku poprawienia odporności na porastanie u żyta Katedra Genetyki i Hodowli Roślin Akademia Rolnicza w Szczecine

2 Cel pracy Opracowanie systemu loci markerowych dla długości spoczynku ziarniaków oraz aktywności alfa-amylazy Weryfikacja skuteczności selekcji MAS Określenie przybliżonej lokalizacji genów warunkujących skłonność (odporność) do porastania oraz poziom aktywności alfa-amylazy Próba poznania podłoża genetycznego porastania u żyta

3 Właściwości linii wsobnych żyta:
541 Ot1-3 Nie zaobserwowano porastania w warunkach polowych W warunkach prowokacji porastanie nie przekraczało 5% Obserwowano niską aktywność alfa - amylazy Porastanie na poziomie 60-85% w warunkach prowokacji Obserwowano zielone siewki w kłosie przed zbiorem Obserwowano wysoką aktywność alfa – amylazy w ziarnie

4 Metody badawcze 1. Ocena porastania w warunkach prowokacyjnych
2. Ocena aktywności alfa-amylazy metodą dyfuzji radiacyjnej 3. Analiza QTL w programie MapMakerQTL/1.1 4. Polimorfizm markerów RAPD wg metodyki Williamsa i in. (1990)

5 Poszukiwanie markerów molekularnych w populacji 94 osobników F2
ETAP 1 Poszukiwanie markerów molekularnych w populacji 94 osobników F2 metodą mapowania interwałowego

6

7 odległość od najbliższego markera
Charakterystyka QTL związanych z aktywnością alfa-amylazy QTL najbliższy marker odległość od najbliższego markera [cM] LOD VE [%] a [mm] d d/a Q AMY uas-K2R pr529/650pz 2,0 4,97 9,5 2,5902 -2,4939 -0,96 Q AMY uas-K3R pr529/520pz 4,0 5,28 8,6 2,3108 -3,6120 -1,56 Q AMY uas-K4R pr1139/840pz 2,19 1,8 -1,1635 0,3397 -0,29 Q AMY uas-K5R pr1056/ 1900pz 5,94 9,7 -2,3586 -3,0716 1,3 Q AMY uas-K6R.1 pr469/600pz 2,90 8,3 -2,2589 -2,8541 1,26 Q AMY uas-K6R.2 pr132/1400pz 8,0 5,22 9,0 -2,3457 -2,7662 1,18 Q AMY uas-K6R.3 pr502/900pz 0,9 5,16 -2,5975 -2,4946 0,96 Q AMY uas-KnsM pr429/930pz 8,32 9,4 2,5492 -2,5874 -1,01 Q AMY uas-KnsL pr139/290pz 6,11 2,7870 -2,2586 -0,81 sumaryczny Q AMY 74,9 1, 2, 3 – określa numer QTL na danym chromosomie VE – wariancja tłumaczona LOD – logarytm ilorazu wiarygodności a – efekt addytywny allela B (rodzic odporny Ot1-3) d – efekt dominacji allela B (rodzic odporny Ot1-3) d/a – sposób działania genu

8 sposób działania korzystnego allela QTL
Sposób działania korzystnego allela QTL dla aktywności alfa-amylazy w ziarnie QTL pochodzenie korzystnego allela allel w locus markerowym sprzężony w układzie cis z korzystnym allelem QTL sposób działania korzystnego allela QTL Q AMY uas-K2R 541 pr529/650pz (null) D Q AMY uas-K3R pr529/520pz (null) Q AMY uas-K4R Ot1-3 pr1139/840pz (null) A Q AMY uas-K5R pr1056/1900pz (null) Q AMY uas-K6R.1 pr469/600pz (null) Q AMY uas-K6R.2 pr132/1400pz (null) Q AMY uas-K6R.3 pr502/900pz (null) Q PHS uas-KnsM pr429/930pz (prążek) Q PHS uas-KnsL pr139/290pz (null) A – addytywność D – dominacja R – recesywność

9 odległość od najbliższego markera
Charakterystyka QTL związanych z odpornością na porastanie locus najbliższy marker odległość od najbliższego markera [cM] LOD VE [%] a d d/a Q PHS uas-K1R pr536/900pz 0,0 2,60 3,4 -9,9495 -4,4683 0,45 Q PHS uas-K2R.1 pr429/490pz 4,22 13,2 -12,4870 -23,1080 1,85 Q PHS uas-K2R.2 pr910/1550pz 10,0 2,80 13,0 -10,1125 -9,2541 0,92 Q PHS uas-K6R pr469/600pz 4,4 -12,448 -10,182 0,82 Q PHS uas-K7R.1 pr966/350pz 2,95 5,0 -12,024 -1,0927 0,09 Q PHS uas-K7R.2 pr568/980pz 4,0 4,21 6,5 -9,9721 -9,2495 0,93 Q PHS uas-KnsP pr354/280pz 2,0 5,07 16,4 20,298 -12,916 -0,63 Q PHS uas-KnsM pr568/1200pz 1,4 3,37 16,0 18,278 -22,691 -1,24 sumaryczny Q PHS 77,9 1, 2, 3 – określa numer QTL na danym chromosomie VE – wariancja tłumaczona LOD – logarytm ilorazu wiarygodności a – efekt addytywny allela B (rodzic odporny Ot1-3) d – efekt dominacji allela B (rodzic odporny Ot1-3) d/a – sposób działania genu

10 Sposób działania korzystnego allela QTL dla porastania w kłosie
locus pochodzenie korzystnego allela QTL allel w locus markerowym sprzężony w układzie cis z korzystnym allelem QTL sposób działania korzystnego allela QTL Q PHS uas-K1R Ot1-3 pr536/900pz (prążek) A Q PHS uas-K2R.1 pr429/490pz (null) ND Q PHS uas-K2R.2 pr910/1550pz (null) D Q PHS uas-K6R pr469/600pz (null) Q PHS uas-K7R.1 pr966/350pz (null) Q PHS uas-K7R.2 541 pr568/980pz (null) Q PHS uas-KnsP pr354/280pz (prążek) D/A Q PHS uas-KnsM pr568/1200pz (prążek) A – addytywność D – dominacja R – recesywność ND – naddominacja 1, 2 – określa numer QTL na danym chromosomie

11 Etap 2 Analiza działania markerów w populacji 360 osobników F2 metodą genotypowania

12 Charakterystyka markerów RAPD użytych do oceny efektu korzystnego allela na aktywność alfa-amylazy
średnia genotypów odpowiadających 541 [U/ml] średnia genotypów odpowiadających Ot1-3 różnica 541 i Ot1-3 Pr 1108/740pz 14,2 11,3 2,9* Pr1056/1900pz 9,4 7,4 1,9 Pr 502/900pz 7,0 2,7 4,4* Pr 529/650pz 13,6 8,2 5,4* Pr 529/520pz 12,4 3,0* Pr 139/290pz 4,9 19,7 -14,8* Pr 429/930pz 7,8 6,8 1,0 Pr 740/1050pz 8,5 0,8 Pr 910/490pz 7,1 1,4 * średnie genotypów 541 i Ot1-3 różnią się istotnie na podstawie testu t-Studenta; P=0,05

13 Charakterystyka markerów RAPD użytych do oceny efektu korzystnego allela na poziom porastania
średnia genotypów odpowiadających 541 [%] średnia genotypów odpowiadających Ot1-3 różnica 541 i Ot1-3 Pr 536/900pz 33,7 29,9 3,8 Pr 966/350pz 34,9 27,1 7,8* Pr 429/490pz 35,7 26,2 9,5* Pr 132/1400pz 33,0 31,0 2,0 Pr 3/1100pz 32,1 30,7 1,4 Pr568/1200pz 30,3 1,8 Pr 354/280pz 33,4 27,9 5,5* Pr 910/1550pz 35,0 27,0 8,0* Pr 469/600pz 33,1 29,7 3,4 * średnie genotypów 541 i Ot1-3 różnią się istotnie na podstawie testu t-Studenta; P=0,05

14 Efekt działania skumulowanego korzystnych alleli na poziom porastania
średnia pr966/350pz pr429/490pz pr910/1550pz pr469/600pz 33 27 19 16 9

15 Efekt działania skumulowanego korzystnych alleli na aktywność alfa-amylazy
średnia pr139/290pz pr502/900pz pr1056/1900pz 5,9 3,9 2,8 2,2

16 Etap 3 Selekcja z wykorzystaniem markerów molekularnych w populacji 5000 osobników F2 (marker assisted selection)

17 Schemat selekcji MAS w populacji 5000 osobników F2 mieszańca 541xOt1-3
na etapie siewki 5000 osobników Selekcja markerem pr966/350pz Wyodrębniono grupę ok osobników o genotypie pr966/350pz(null)

18 Wyodrębniono grupę ok. 400 osobników o genotypie
Selekcja markerem pr429/490pz Wyodrębniono grupę ok. 400 osobników o genotypie pr966/350pz(null)+pr429/490pz(null)

19 Wyodrębniono grupę ok. 120 osobników o genotypie
Selekcja markerem 910/1550pz Wyodrębniono grupę ok. 120 osobników o genotypie Pr966/350pz(null)+pr429/490pz(null)+pr910/1550pz(null)

20 Wyodrębniono 27 osobników
Selekcja markerem 469/600pz Wyodrębniono 27 osobników pr966/350pz(null)+pr429/490pz(null)+pr910/1550pz(null) +pr469/600pz(null)

21 Rozkład zmienności porastania w populacji 5000 osobników F2

22 Udział osobników o potwierdzonej odporności na porastanie w grupie wyselekcjonowanej markerami
1 6 7 1 6 7 1 2 4 1 2 7

23 Rozkład zmienności aktywności alfa-amylazy
w populacji 2500 osobników F2

24 markerów selekcyjnych
Selekcja MAS pod kątem niskiej aktywności alfa-amylazy i ocena frekwencji markerów RAPD w grupie 28 osobników o najniższej aktywności Analiza 2500 osobników F2pod kątem aktywności alfa-amylazy Wybór grupy o najniższej aktywności Analiza wybranych pojedynków pod względem markerów RAPD 15 osobników F2 posiadało komplet trzech markerów selekcyjnych

25 Wyodrębnione grupy skrajne
28 osobników z niską aktywnością alfa-amylazy (0,46U/ml) 30 osobników z wysoką aktywnością alfa-amylazy (75,68U/ml) 67 osobników odpornych na porastanie (0%) 32 osobniki wrażliwe na porastanie (100%)

26 Frekwencja markerów oraz wartość odchylenia od 3:1w grupach skrajnych gdzie faworyzowany jest allel null Lokali- Zacja marker pochodzenie prążka korzystny allel grupa skrajna prążek null 2 (3:1) 1R 841/850pz 541 - O 37 30 14,0*** 536/900pz Ot1-3 + W 13 19 20,1*** 1108/740pz 14 53 43,1*** 2R 429/490pz 17 50 88,0*** 910/490pz 15 52 72,8*** 910/1550pz 18 49 82,8*** 6R 469/600pz 24 43 54,9*** 7R 738/1100pz 23 44 59,1*** 966/350pz 20 47 234/550pz 29 38 35,9*** 1192/500pz 48 0,4 568/980pz 35 32 18,5*** 1008/1050pz 42 25 5,4* ns 3/1100pz 22 10 0,67 568/1200pz 12 2,7 354/280pz 7 1,5

27 Frekwencja markerów oraz wartość odchylenia od 3:1w grupach skrajnych gdzie faworyzowany jest allel null lokalizacja marker pochodzenie prążka korzystny allel grupa skrajna prążek null 2 (3:1) 2R 529/650pz Ot1-3 + W 15 13 6,9** 3R 1049/670pz Ot-3 - N 20 8 0,19 1059/830pz 128/460pz 16 12 4,8* 529/520pz 19 9 0,8 4R 1139/840pz 541 15,4*** 5R 740/770pz 10 18 23,0*** 1056/1900pz 12,1*** 1091/850pz 11 17 19,0*** 6R 469/600pz 502/900pz 132/1400pz 3,1 L 139/290pz M 429/900 21 0,4

28

29

30 Analiza frekwencji markerów u poszczególnych osobników grupy skrajnej „odporność na porastanie”
Analizowano 6 loci makrkerowych Stwierdzono obecność od 3 do 5 korzystnych alleli u poszczególnych osobników odpornych na porastanie 30 osobników posiadało cztery markery 22 osobniki posiadały pięć markerów 15 osobników posiadało trzy markery Najczęstsze trójki markerów : pr1108/pr910c/pr586c oraz pr1108/pr429a/pr586c

31 Analiza frekwencji markerów u poszczególnych osobników grupy skrajnej „niska aktywność”
Stwierdzono obecność od 2 do czterech korzystnych alleli 14 osobników posiadało 3 allele 13 posiadało 4 allele 1 osobnik posiadał dwa allele Brak jednej kombinacji markerów, która występowałaby częściej niż pozostałe

32 Ranking markerów Dla głębokości spoczynku Dla aktywności alfa-amylazy
Pr 429/490pz [2R] Pr 139/290pz [ns] Pr502/900[6R] Pr 910/1550 [2R] Pr 966/350pz [7R] Pr1056/1900pz [5R] Pr 469/600pz [6R] Pr529/650pz [1R] Pr354/280 [ns] Pr529/520pz [2R]

33 Wnioski Cechy odporność na porastanie i aktywność alfa-amylazy wykazują podłoże wielogenowe Selekcja w oparciu o kilka loci markerowych jest skutecznym narzędziem do wyodrębniania pojedynków odpornych na porastanie Piramidyzacja korzystnych alleli w poszczególnych genotypach jest dobrą metodą uzyskiwania form o pożądanych cechach użytkowych