Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display Another way to copy DNA is a technique called polymerase chain.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display Another way to copy DNA is a technique called polymerase chain."— Zapis prezentacji:

1 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display Another way to copy DNA is a technique called polymerase chain reaction (PCR) Another way to copy DNA is a technique called polymerase chain reaction (PCR) It was developed by Kary Mullis in 1985 It was developed by Kary Mullis in 1985 Unlike gene cloning, PCR can copy DNA without the aid of vectors and host cells Unlike gene cloning, PCR can copy DNA without the aid of vectors and host cells Polymerase Chain Reaction 18-38

2 Hot water bacteria: Thermus aquaticus Taq DNA polymerase Life at High Temperatures by Thomas D. Brock Biotechnology in Yellowstone © 1994 Yellowstone Association for Natural Science

3 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display The starting material for PCR includes The starting material for PCR includes 1. Template DNA 1. Template DNA Contains the region that needs to be amplifiedContains the region that needs to be amplified 2. Oligonucleotide primers 2. Oligonucleotide primers Complementary to sequences at the ends of the DNA fragment to be amplifiedComplementary to sequences at the ends of the DNA fragment to be amplified These are synthetic and about nucleotides longThese are synthetic and about nucleotides long 3. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) 3. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) Provide the precursors for DNA synthesisProvide the precursors for DNA synthesis 4. Taq polymerase 4. Taq polymerase DNA polymerase isolated from the bacterium Thermus aquaticusDNA polymerase isolated from the bacterium Thermus aquaticus This thermostable enzyme is necessary because PCR involves heating steps that inactivate most other DNA polymerasesThis thermostable enzyme is necessary because PCR involves heating steps that inactivate most other DNA polymerases 18-39

4 Example thermal cycler protocol used in lab: Step 17 min at 94˚CInitial Denature Step 245 cycles of: 20 sec at 94˚CDenature 20 sec at 52˚CAnneal 1 min at 72˚CExtension Step 37 min at 72˚CFinal Extension Step 4Infinite hold at 4˚CStorage BIOL 362 samples processed in: MJ Research DNA Engine Dyad

5 5-AAGCGATGACAAGATCAACAGCTGATCGATCGT-3 3-TTCGCTACTGTTCTAGTTGTCGACTAGCTAGCA-5 5-AAGCGATGA Primer 1 (sense) CTAGCTAGCA-5 Primer 2 (antisense) DNA primers for PCR Primers are generally designed to have a T m of ~55°C - T m = temperature at which 50% of duplex is denatured. - More G/C base pairs = higher T m temperature % single stranded 50% TmTm ~95° C 100%

6 18-40 PCR is carried out in a thermocycler, which automates the timing of each cycle PCR is carried out in a thermocycler, which automates the timing of each cycle All the ingredients are placed in one tube All the ingredients are placed in one tube The experimenter sets the machine to operate within a defined temperature range and number of cycles The experimenter sets the machine to operate within a defined temperature range and number of cycles Binding of the primers to the DNA is called annealing

7 18-41 With each successive cycle the relative amount of this type of DNA fragment increases. Therefore, after many cycles, the vast majority of DNA fragments only contain the region that is flanked by the two primers The sequential process of denaturing-annealing- synthesis is then repeated for many cycles The sequential process of denaturing-annealing- synthesis is then repeated for many cycles A typical PCR run is likely to involve 20 to 30 cycles of replication A typical PCR run is likely to involve 20 to 30 cycles of replication This takes a few hours to complete This takes a few hours to complete After 20 cycles, a DNA sample will increase fold (~ 1 million-fold) After 20 cycles, a DNA sample will increase fold (~ 1 million-fold) After 30 cycles, a DNA sample will increase fold (~ 1 billion-fold) After 30 cycles, a DNA sample will increase fold (~ 1 billion-fold)

8 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display The PCR reaction shown in Figure 18.6 seeks to amplify a specific DNA segment The PCR reaction shown in Figure 18.6 seeks to amplify a specific DNA segment For this type of experiment, a researcher must have prior knowledge about the sequence of the template DNA For this type of experiment, a researcher must have prior knowledge about the sequence of the template DNA This, in order, to construct the synthetic primersThis, in order, to construct the synthetic primers PCR can also be used to amplify chromosomal DNA semispecifically or nonspecifically PCR can also be used to amplify chromosomal DNA semispecifically or nonspecifically 1. Semispecific approach 1. Semispecific approach Primers recognize a repetitive DNA sequence found at several sites within the genomePrimers recognize a repetitive DNA sequence found at several sites within the genome Therefore, many different DNA fragments will be amplified Therefore, many different DNA fragments will be amplified 2. Nonspecific approach 2. Nonspecific approach A mixture of primers with many different random sequences is usedA mixture of primers with many different random sequences is used These will anneal randomly throughout the genome and amplify most of the chromosomal DNA These will anneal randomly throughout the genome and amplify most of the chromosomal DNA 18-42

9 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display PCR is also used to detect and quantitate the amount of RNA in living cells PCR is also used to detect and quantitate the amount of RNA in living cells The method is called reverse transcriptase PCR (RT-PCR) The method is called reverse transcriptase PCR (RT-PCR) RT-PCR is carried out in the following manner RT-PCR is carried out in the following manner RNA is isolated from a sample RNA is isolated from a sample It is mixed with reverse transcriptase and a primer that will anneal to the 3 end of the RNA of interest It is mixed with reverse transcriptase and a primer that will anneal to the 3 end of the RNA of interest This generates a single-stranded cDNA which can be used as template DNA in conventional PCR This generates a single-stranded cDNA which can be used as template DNA in conventional PCR RT-PCR is extraordinarily sensitive RT-PCR is extraordinarily sensitive It can detect the expression of small amounts of RNA in a single cellIt can detect the expression of small amounts of RNA in a single cell 18-43

10 Diagnostyka molekularna w wykrywaniu czynników infekcyjnych i badaniach epidemiologicznych

11 Powszechnie stosowane metody wykrywania i identyfikacji drobnoustrojów opierają się głównie na badaniu cech morfologicznych, serologicznych i biochemicznych. Powszechnie stosowane metody wykrywania i identyfikacji drobnoustrojów opierają się głównie na badaniu cech morfologicznych, serologicznych i biochemicznych.

12 Ostatnie osiągnięcia biologii molekularnej i biotechnologii szybko zmieniają procedury diagnostyczne stosowane w analizie mikrobiologicznej. Ostatnie osiągnięcia biologii molekularnej i biotechnologii szybko zmieniają procedury diagnostyczne stosowane w analizie mikrobiologicznej. Bakterie chorobotwórcze, a także wirusy, grzyby i pasożyty, wcześniej izolowane i identyfikowane pracochłonnymi i długotrwałymi metodami klasycznej mikrobiologii mogą dzisiaj być wykrywane przez zastosowanie testów opartych na analizie kwasów nukleinowych. Jedną z najbardziej eksploatowanych metod w tych próbach, opartych na analizie materiału genetycznego, jest technika PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy), która w ciągu kilku lat stała się jedną z podstawowych technik zarówno badawczych, jak i diagnostycznych. Bakterie chorobotwórcze, a także wirusy, grzyby i pasożyty, wcześniej izolowane i identyfikowane pracochłonnymi i długotrwałymi metodami klasycznej mikrobiologii mogą dzisiaj być wykrywane przez zastosowanie testów opartych na analizie kwasów nukleinowych. Jedną z najbardziej eksploatowanych metod w tych próbach, opartych na analizie materiału genetycznego, jest technika PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy), która w ciągu kilku lat stała się jedną z podstawowych technik zarówno badawczych, jak i diagnostycznych.

13 Zasady reakcji PCR Technika łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) pozwala na selektywną amplifikację DNA in vitro przez naśladowanie zjawiska replikacji DNA in vivo. Wymaga następujących czynników reakcji: jednoniciowej matrycy DNA, jednoniciowej matrycy DNA, starterów (sekwencji oligonukleotydów komplementarnych do końców zdefiniowanej sekwencji matrycowego DNA), starterów (sekwencji oligonukleotydów komplementarnych do końców zdefiniowanej sekwencji matrycowego DNA), trójfosforanów deoksynukleozydów (dNTP) i trójfosforanów deoksynukleozydów (dNTP) i enzymu termostabilnej polimerazy DNA. enzymu termostabilnej polimerazy DNA.

14 Reakcja PCR przebiega cyklicznie, a każdy cykl złożony jest z trzech etapów: denaturacji dupleksu DNA ( C), denaturacji dupleksu DNA ( C), dołączania starterów do miejsca komplementarnego matrycy ( C), dołączania starterów do miejsca komplementarnego matrycy ( C), wydłużania startera od końca 3'-OH przez sukcesywne dosyntetyzowanie dNTP w temperaturze 72 0 C. wydłużania startera od końca 3'-OH przez sukcesywne dosyntetyzowanie dNTP w temperaturze 72 0 C.

15 W większości zastosowań techniki PCR, takie czynniki jak: odpowiedni wybór, odpowiedni wybór, charakter sekwencji i charakter sekwencji i kombinacje stosowanych starterów odgrywają zasadniczą rolę w osiągnięciu pozytywnych rezultatów amplifikacji pożądanego produktu. kombinacje stosowanych starterów odgrywają zasadniczą rolę w osiągnięciu pozytywnych rezultatów amplifikacji pożądanego produktu. W zależności od celu, użyteczna długość starterów wynosi od 14 do 40 nt, z zawartością par G+C w zakresie 40-75%. W zależności od celu, użyteczna długość starterów wynosi od 14 do 40 nt, z zawartością par G+C w zakresie 40-75%.

16 Ogólne zasady projektowania specyficznych starterów w reakcjach diagnostycznych dotyczą: startery powinny być komplementarne do sekwencji genomu zlokalizowanych wewnątrz regionów wysoce konserwatywnych dla analizowanego rodzaju; startery powinny być komplementarne do sekwencji genomu zlokalizowanych wewnątrz regionów wysoce konserwatywnych dla analizowanego rodzaju; 3' końce starterów powinny zawierać kodony niezdegenerowane (np., dla Trp i Met); 3' końce starterów powinny zawierać kodony niezdegenerowane (np., dla Trp i Met); 3' końce starterów powinny być niekomplementarne w stosunku do siebie (brak możliwości tworzenia dimerów); 3' końce starterów powinny być niekomplementarne w stosunku do siebie (brak możliwości tworzenia dimerów); poszczególne startery nie powinny zawierać sekwencji palindromicznych; poszczególne startery nie powinny zawierać sekwencji palindromicznych; nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych; nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych; należy unikać w sekwencjach starterów nierównej dystrybucji rejonów bogatych w G/C lub A/T. należy unikać w sekwencjach starterów nierównej dystrybucji rejonów bogatych w G/C lub A/T. Większość zastosowań reakcji PCR kontrolowana jest głównie przez odpowiednie projektowanie oraz wybór kombinacji starterów.

17 Zastosowania techniki PCR w diagnostyce molekularnej Diagnostyka molekularna, oparta o metody analizy materiału genetycznego (w tym na technice PCR), znajduje praktyczne zastosowania w wielu dziedzinach medycyny między innymi takich jak: diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie, diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie, diagnostyka chorób infekcyjnych, diagnostyka chorób infekcyjnych, wczesne wykrywanie nowotworów, wczesne wykrywanie nowotworów, diagnostyka sanitarna, diagnostyka sanitarna, diagnostyka w medycynie sądowej, diagnostyka w medycynie sądowej, transplantologia. transplantologia.

18 Gwałtowny rozwój biologii molekularnej, w szczególności w ostatnich 20 latach, otworzył nowe możliwości dla diagnostyki mikrobiologicznej. Klasyczne metody identyfikacji i różnicowania drobnoustrojów opierają się głównie na obserwacji cech fenotypowych, czyli na ocenie poziomu ekspresji cech biochemicznych, morfologii kolonii, barwieniu komórek, otoczek, przetrwalników oraz określaniu wrażliwości na antybiotyki i bakteriofagi. Wysoki poziom zmienności fenotypowej wśród populacji bakteryjnej może jednak prowadzić do zafałszowania wyników przeprowadzanych analiz, co w niektórych przypadkach może okazać się katastrofalne w skutkach.

19 Drugą połowę dwudziestego wieku cechuje bardzo dynamiczny rozwój technik biologii molekularnej. W sytuacji, gdy stwierdza się niewystarczalność metod fenotypowych pomocne mogą okazać się techniki typowania mikroorganizmów oparte na analizie materiału genetycznego - metody genotypowe. Materiał genetyczny jest unikalny i stały (niezmienny w porównaniu do cech fenotypowych) dla każdego organizmu. Z tego względu metody genotypowe znajdują coraz szersze zastosowanie w diagnostyce mikrobiologicznej (identyfikacji, wykrywaniu, różnicowaniu).

20 Dzięki technice PCR uległa zwiększeniu czułość i specyficzność badań diagnostycznych. Wprowadzenie do diagnostyki medycznej techniki PCR uprościło również procedury badawcze umożliwiając ich automatyzację i powstanie szeregu handlowo dostępnych testów. Jedną z najbardziej eksploatowanych metod opartych na analizie materiału genetycznego jest technika PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy), która w ciągu kilku lat stała się jedną z podstawowych technik zarówno badawczych, jak i diagnostycznych. Metody biologii molekularnej i inżynierii genetycznej, w tym także technika PCR, znalazły także szerokie zastosowanie do różnicowania mikroorganizmów, np. w badaniach epidemiologicznych zakażeń szpitalnych.

21 Metodami analizy DNA można skutecznie rozpoznawać szereg chorób infekcyjnych. Szczególny postęp zanotowano w diagnostyce patogenów wolno rosnących lub trudnych do hodowli. Wszędzie tam gdzie jest to możliwe i opłacalne, diagnostyka klasyczna zostaje zastąpiona lub uzupełniona przez amplifikację charakterystycznego dla patogenu fragmentu DNA w tzw diagnostyce molekularnej. Metodami analizy DNA można skutecznie rozpoznawać szereg chorób infekcyjnych. Szczególny postęp zanotowano w diagnostyce patogenów wolno rosnących lub trudnych do hodowli. Wszędzie tam gdzie jest to możliwe i opłacalne, diagnostyka klasyczna zostaje zastąpiona lub uzupełniona przez amplifikację charakterystycznego dla patogenu fragmentu DNA w tzw diagnostyce molekularnej.

22 Metody biologii molekularnej, w tym także technika PCR, znalazły szerokie zastosowanie do różnicowania mikroorganizmów np. w badaniach epidemiologicznych. Metody biologii molekularnej, w tym także technika PCR, znalazły szerokie zastosowanie do różnicowania mikroorganizmów np. w badaniach epidemiologicznych.

23 Różnicowanie lub inaczej typowanie mikroorganizmów ma ogromne znaczenie w mikrobiologii medycznej. Różnicowanie lub inaczej typowanie mikroorganizmów ma ogromne znaczenie w mikrobiologii medycznej. Służy ono badaniu ich epidemiologii, czyli m. in. ekologicznych zachowań drobnoustrojów i dróg ich rozprzestrzeniania. Służy ono badaniu ich epidemiologii, czyli m. in. ekologicznych zachowań drobnoustrojów i dróg ich rozprzestrzeniania. Określanie unikalnych cech organizmów za pomocą typowania umożliwia badanie kolonizacji i zakażeń szpitalnych, a także pozwala na wyznaczanie powiązań filogenetycznych między mikroorganizmami. Określanie unikalnych cech organizmów za pomocą typowania umożliwia badanie kolonizacji i zakażeń szpitalnych, a także pozwala na wyznaczanie powiązań filogenetycznych między mikroorganizmami.

24 Zagrożenia w metodach amplifikacji kwasów nukleinowych Wyniki fałszywie pozytywne Kontaminacja postamplifikacyjnym produktem Kontaminacja postamplifikacyjnym produktem Kontaminacja reagentów Kontaminacja reagentów Kontaminacja organizmem podczas przygotowywania kontroli pozytywnej lub próbek dodatnich Kontaminacja organizmem podczas przygotowywania kontroli pozytywnej lub próbek dodatnich

25 Zagrożenia w metodach amplifikacji kwasów nukleinowych Wyniki fałszywie nagatywne Inhibitory reakcji Inhibitory reakcji Błąd w objętości próbek Błąd w objętości próbek Błąd wykonawcy Błąd wykonawcy Zła izolacja kwasów nukleinowych Zła izolacja kwasów nukleinowych Zepsucie aparatury (termocykler) Zepsucie aparatury (termocykler) Problemy związane z reagentami (stężenie magnezu, synteza primerów) Problemy związane z reagentami (stężenie magnezu, synteza primerów)

26 Zagrożenia w metodach amplifikacji kwasów nukleinowych Zbyt duża czułość Przypadkowe pojawienie się patogena, wykrywanie martwych organizmów Przypadkowe pojawienie się patogena, wykrywanie martwych organizmów

27 PROBLEM SZCZEPÓW OPORNYCH NA PRZYKŁADZIE STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1940r. wprowadzenie penicyliny do terapii – wszystkie izolowane szczepy wrażliwe; 1940r. wprowadzenie penicyliny do terapii – wszystkie izolowane szczepy wrażliwe; 5 lat później, 50% izolatów opornych na penicylinę (ekspresja b- laktamaz); 5 lat później, 50% izolatów opornych na penicylinę (ekspresja b- laktamaz); 1960r. wprowadzenie metycyliny do terapii – wszystkie izolowane szczepy wrażliwe (w tym szczepy oporne na penicylinę); 1960r. wprowadzenie metycyliny do terapii – wszystkie izolowane szczepy wrażliwe (w tym szczepy oporne na penicylinę); rok później, izolacja szczepów opornych w Europie (MRSA), inny mechanizm oporności – gen mecA kodujący białko PBP2a; rok później, izolacja szczepów opornych w Europie (MRSA), inny mechanizm oporności – gen mecA kodujący białko PBP2a; 1970r. zakażenia szpitalne MRSA w wielu szpitalach europejskich; 1970r. zakażenia szpitalne MRSA w wielu szpitalach europejskich; lata 80, szczepy MRSA oporne na wszystkie nowe antybiotyki b- laktamowe; lata 80, szczepy MRSA oporne na wszystkie nowe antybiotyki b- laktamowe; 1958r. wprowadzenie vankomycyny do terapii – szczepy MRSA wrażliwe; 1958r. wprowadzenie vankomycyny do terapii – szczepy MRSA wrażliwe; 1987r. izolacja pierwszych vankomycyno-opornych szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych; 1987r. izolacja pierwszych vankomycyno-opornych szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych; 1988r. izolacja pierwszych vankomycyno-opornych szczepów enterokoków (VRE). 1988r. izolacja pierwszych vankomycyno-opornych szczepów enterokoków (VRE).

28 ALARM! Pytanie. Czy geny oporności na vankomycynę mogą być przeniesione z stosunkowo avirulentnych szczepów enterokoków do bardzo virulentnych szczepów Staphylococcus aureus? Pytanie. Czy geny oporności na vankomycynę mogą być przeniesione z stosunkowo avirulentnych szczepów enterokoków do bardzo virulentnych szczepów Staphylococcus aureus?

29 Odpowiedź pozytywna, świadczą o tym: 1992r. opublikowane eksperymenty transferu oporności na vankomycynę in vitro i in vivo z enterokoków do S. aureus; 1992r. opublikowane eksperymenty transferu oporności na vankomycynę in vitro i in vivo z enterokoków do S. aureus; doniesienia o nieskuteczności każdej terapii antybiotykowej infekcji spowodowanych koagulazo- ujemnymi gronkowcami lub enterokokamii; doniesienia o nieskuteczności każdej terapii antybiotykowej infekcji spowodowanych koagulazo- ujemnymi gronkowcami lub enterokokamii; 1997r. doniesienia o izolacji szczepów S. aureus z umiarkowaną opornością na vankomycynę (MIC, 8 mg/mL) w Japonii i USA; 1997r. doniesienia o izolacji szczepów S. aureus z umiarkowaną opornością na vankomycynę (MIC, 8 mg/mL) w Japonii i USA; koniec 1997r., informacja, że około 20% izolatów MRSA wykazywało umiarkowaną oporność na vankomycynę (MIC, od 2-9 mg/mL); koniec 1997r., informacja, że około 20% izolatów MRSA wykazywało umiarkowaną oporność na vankomycynę (MIC, od 2-9 mg/mL); koniec 1997r., uzyskano laboratoryjny mutant S. aureus z wysoką opornością na vankomycynę (MIC, 100 mg/mL). koniec 1997r., uzyskano laboratoryjny mutant S. aureus z wysoką opornością na vankomycynę (MIC, 100 mg/mL).

30 PRZYKŁAD Barski, P., Piechowicz, L., Galiński, J and Kur, J.: Rapid assay for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using multiplex PCR. Mol. Cell. Probes 10 (1996) Wykrywanie Staphylococcus aureus i oznaczanie jego oporności na antybiotyki laktamoweprzy użyciu metody Multiplex PCR

31 Wykrywanie Staphylococcus aureus i oznaczanie jego oporności na antybiotyki laktamowe przy użyciu metody Multiplex PCR

32 WNIOSKI Opracowano nową metodę oznaczania oporności na antybiotyki -laktamowe, którą można polecić jako referencyjną. Metoda ta opiera się na technice PCR i odpowiada na dwa podstawowe pytania formułowane przy stawianiu diagnozy dotyczącej zakażeń gronkowcowych. Pytania te brzmią następująco: 1. Czy czynnikiem zakaźnym jest S. aureus ? 2. Czy czynnik zakaźny jest oporny na antybiotyki -laktamowe ?

33 Opracowana metoda wykazuje szereg przewag względem konwencjonalnych metod oznaczania oporności na metycylinę: 1. Większa czułość (wykrywa się szczepy, których oporność na antybiotyki -laktamowe została potwierdzona tylko reakcją MPCR). 2. Znacznie krótszy czas wykonania testu (ok. 4 godzin). 3. Pewność wyników oparta o racjonalne rozpoznanie genetycznej natury oporności na antybiotyki -laktamowe (układ nuc/mec MPCR unika wszystkich problemów diagnostycznych związanych z fenotypową ekspresją oporności, jest bowiem metodą genotypową).

34 Zastosowanie opracowanej metody może mieć szersze skutki w lecznictwie (antybiotyki glikopeptydowe są nadużywane w leczeniu zakażeń gronkowcowych w przypadkach błędnej identyfikacji szczepów wrażliwych na metycylinę jako szczepów opornych). Oparte na rzetelnej diagnozie, ograniczenie użycia antybiotyków glikopeptydowych, tylko do przypadków zakażeń faktycznie wywołanych przez szczepy MRSA, może spowolnić rozwój oporności na te antybiotyki, pozostające jedynymi jak dotąd skutecznymi lekami przeciwko gronkowcom opornym na - laktamy.

35 Przykład rozwiązań diagnostycznych identyfikacji czynników etiologicznych chorób rozpowszechnianych drogą płciową Chlamydia trachomatis, jeden z częstszych czynników etiologicznych chorób rozpowszechnianych drogą płciową Oferta diagnostyki Chlamydia trachomatis jednego z amerykańskich laboratoriów diagnostycznych obejmuje: hodowlę in vitro; analizę mikroskopową po znakowaniu fluoryzującym przeciwciałem monoklonalnym (ang. direct fluorescent antibody, DFA); wykrywanie antygenu przy pomocy testów immunoenzymatycznych (ang. enzyme linked immunosorbent assay, ELISA); test hybrydyzacyjny wykrywający rybosomalny RNA; wykrywanie techniką PCR specyficznego plazmidu, obecnego w bakteriach.

36 Ten ostatni test (PCR) jest znacznie bardziej czuły ( %), niż hodowla (70- 85%), DFA (85%), ELISA ( %) i hybrydyzacja ( %). Specyficzność i czułość (ang. positive predictive value, PPV) testów wykorzystujących metodę PCR wynosi ponad 99%, a więc znacznie przewyższa wartość tego parametru dla pozostałych metod. Należy się spodziewać, że w najbliższym czasie wiele czołowych laboratoriów referencyjnych zaadaptuje metody diagnostyki molekularnej, zwłaszcza gdy powstanie możliwość rutynowego badania wielu różnych patogenów jednocześnie.

37 Metody typowania mikroorganizmów oparte o analizę kwasów nukleinowych Określanie unikalnych cech organizmów za pomocą typowania umożliwia badanie kolonizacji i zakażeń szpitalnych, a także pozwala na wyznaczanie powiązań filogenetycznych między mikroorganizmami. Wyniki takich badań mogą być podstawą do wprowadzenia środków zapobiegawczych i działań sanitarnych, mających ograniczyć rozprzestrzenianie się zakażeń szpitalnych i związanej z nimi lekooporności.

38 Metody genotypowe najczęściej stosowane do badań epidemiologicznych to: rybotypowanie, elektroforeza pulsacyjna genomu ciętego rzadko tnącymi enzymami restrykcyjnymi (PFGE), ustalanie sekwencji nukleotydowej specyficznego regionu w genomie, różne odmiany techniki PCR fingerprinting. Z wymienionych największą moc dyskryminacyjną mają techniki polegające na analizie całego materiału genetycznego komórki. Nawet dwaj przedstawiciele tego samego gatunku, i spokrewnieni ze sobą, różnią się od siebie na poziomie materiału genetycznego, tak jak ludzie różnią się układami linii papilarnych popularnie nazywanymi odciskami palców (stąd nazwa tej metody, fingerprinting).

39 Cechy efektywnej metody typowania szczepów: Wysoki stopień dyskryminacji Powtarzalność Zdolność do typowania wszystkich szczepów Prosta w użyciu Szybkość Mało kosztowna Wystandaryzowana

40 Złoty standard w typowaniu mikroorganizmów Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową (RFLP-PFGE) Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego totalnego DNA genomowego trawieniu enzymatycznemu z zastosowaniem restryktaz. Liczba i wielkość otrzymanych fragmentów DNA determinowana jest przez długość sekwencji rozpoznawanej przez określony enzym restrykcyjny oraz charakter trawionego DNA (% zawartości par zasad GC w stosunku do AT).

41 W wyniku trawienia otrzymujemy fragmenty DNA o wielkościach od ok. 0.5 kpz do 1000 kpz. Rozdziału otrzymanych fragmentów restrykcyjnych dokonuje się w agarozowej elektroforezie pulsowej (ang. PFGE – Pulsed Field Gel Elektrophresis). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych możliwa dzięki elektroforezie pulsowej powoli staje się metodą standardową w epidemiologii szpitalnej.

42

43 Otrzymane wzory restrykcyjne mogą również zostać zafałszowane przez fragmenty pochodzące z plazmidowego DNA, izolującego się łącznie z DNA chromosomalnym. WADY Trudna w wykonaniu, kosztowna, wymaga skomplikowanej aparatury i zachowania stałych warunków analizy. Częste zachodzenie i pokrywanie się fragmentów DNA o zbliżonej wielkości, co powoduje, iż otrzymany obraz elektroforetyczny staje się trudny do interpretacji.

44 Pozwala na całkowitą dyskryminację szczepów bakteryjnych. ZALETY Wszystkie szczepy są typowalne.

45 Rybotypowanie W związku z funkcją rybosomów w każdym organizmie, a także ich kompleksową naturą, geny kodujące rRNA, ułożone w operon rrn, obecne są we wszystkich organizmach bakteryjnych i są wysoko konserwowane ewolucyjnie. Geny te odpowiedzialne są za syntezę 16S, 23S i 5S rRNA. Ich wysoka konserwacja przejawia się w sekwencji nukleotydowej, a także w strukturze pierwszo- i drugorzędowej. Geny kodujące poszczególne rodzaje rRNA rozdzielone są regionami polimorficznymi, które charakteryzują się wysokim zróżnicowaniem pod względem sekwencji i wielkości.

46 Te cechy genów rDNA czynią z nich dobry molekularny zegar do studiów nad pokrewieństwem filogenetycznym, nawet odległych od siebie organizmów. Rybotypowanie – c.d.

47 Różnicowanie bakterii z zastosowaniem metod rybotypowania można przeprowadzić przy użyciu różnych technik, z wykorzystaniem głównie metod hybrydyzacyjnych lub PCR. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi. Elektroforeza i transfer rozdzielonych fragmentów DNA na filtr. Hybrydyzacja z sondą komplementarną do rDNA. RFLP zhybrydyzowanego z sondą rDNA (rrn loci) rrn RFLP Komórka bakterii Izolacja genomowego DNA METODY HYBRYDYZACYJNE METODY OPARTE NA TECHNICE PCR

48 PCR regionu zmiennego między rrs- rrl rDNA. Elektroforetyczny rozdział produktów PCR. Obserwacja produktów wybarwionych bromkiem etydyny w świetle UV. Polimorfizm długości produktów PCR ITS PCR Amplifikacja określonego fragmentu operonu rrn: -regionu zmiennego pomiędzy genami kodującymi 16S i 23S rRNA, -regionu zmiennego wewnątrz genu kodującego 16S RNA, -regionu zawierającego geny kodujące 16S i 23S rRNA oraz fragment polimorficzny pomiędzy nimi, - regionu zawierającego geny kodujące tRNA. Trawienie otrzymanych produktów enzymami restrykcyjnymi. Elektroforetyczny rozdział produktów PCR. Obserwacja produktów wybarwionych bromkiem etydyny w świetle UV. RFLP produktów amplifikacji regionów operonu rrn ARDRA PCR regionu zawierającego gen kodujący 16S rRNA Sekwencjonowanie otrzymanych produktów PCR.

49 1. Nowak, A., Burkiewicz, A. and Kur, J.: PCR differentiation of seventeen genospecies of Acinetobacter. FEMS Microbiol. Lett. 126 (1995) Kur, J., Burkiewicz, A., Zabłocka, A. and Gospodarek, E.: Identification of Pseudomonas aeruginosa on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Acta Biochim. Polon. 44 (1995) Kur, J., Burkiewicz, A., Samet, A. and Sienkiewicz, I.: Identification of Serratia marcescens on the basis of Polymerase Chain Reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Acta Microbiol. Polon. 44 (1995)

50

51 Amplifikacja znanych regionów genomu połączona z analizą restrykcyjną (PCR/RFLP) Jako cel molekularny w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się fragment DNA specyficzny dla danego gatunku lub kilku gatunków spokrewnionych o podobnym znaczeniu klinicznym. Uzyskane produkty amplifikacji można następnie poddać trawieniu enzymami restrykcyjnymi. W wyniku restrykcyjnego cięcia produktów PCR otrzymuje się specyficzny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych dla danego DNA (RFLP). Połączenie obu technik (PCR i RFLP) pozwala na różnicowanie blisko spokrewnionych organizmów lub szczepów. Wybór odpowiedniej restryktazy jest podyktowany przez charakter produktu amplifikacji.

52 M - marker wielkości DNA (501, 489,404, 331, 242, 190, 147, 111 i 110 pz); K - kontrola negatywna reakcji; 1,7, 12,15, 16,17 - produkty PCR otrzymane na matrycach szczepów Acinetobacter sp. Amplifikacja fragmentu genu recA Acinetobacter sp. Amplifikacja fragmentu genu recA dla sześciu genotypów Acinetobacter. Elektroforogram w 2% żelu agarozowym.

53 Elektroforogram produktów PCR trawionych endonukleazą Tsp5091 klinicznych szczepów Acinetobacter. M – marker wielkości DNA (501,489,404,331,242,190,147,11 i 110 pz) Elektroforogram produktów amplifikacji referencyjnych szczepów Acinetobacter trawionych endonukleazą restrykcyjną Tsp5091. M – marker wielkości DNA (501,489,404,331,242,190,147,11 i 110 pz); Numery studzienek odpowiadają produktom PCR otrzymanym dla szczepów referencyjnych

54 Nowak, A. and Kur, J.: Genomic species typing of acinetobacters by polymerase chain reaction amplification of the recA gene. FEMS Mikrobiol. Lett. 130 (1995) Nowak, A. and Kur, J.: Differentiation of seventeen genospecies of Acinetobacter by multiplex polymerase chain reaction and rstriction fragment length polymorphism analysis. Mol. Cel. Probes 10 (1996) Krawczyk, B., Lewandowski, K., Kur, J.: Comparative studies of the Acinetobacter genusand the species identification method based on the recA sequences. Mol. Cell. Probes 16 (2002) 1-11.

55 PCR fingerprinting Istnieje wiele różnorodnych metod PCR fingerprinting, ale zasadniczo ich wspólnym celem jest powielenie polimorficznego regionu DNA w reakcji PCR z zastosowaniem odpowiednio dobranych starterów. Jedna ż metod PCR fingerprinting wykorzystuje istnienie repetytywnych sekwencji w genomach mikroorganizmów (bakterii, grzybów i pasożytów). Sekwencje te charakteryzują się określoną długością i są szeroko rozpowszechnione w genomie. U bakterii zostały one najwcześniej wykryte i dobrze scharakteryzowane dla Escherichia coli i Salmonella typhimurium. Przykładem tego typu sekwencji są REP (ang. Repetitive Chromosomal Elemets) o długości 38 pz i ERIC (ang. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o długości pz, występujące u bakterii Gram ujemnych.

56 Samet, A., Bronk, M., Hellmann, A., Kur, J. (1999) Isolation and epidemic logical study of vancomycin -resistant Enterococcus faecium from patients of a Haematological Unit in Poland. J. Hosp.Intec

57 AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism) AFLP, łączy w sobie dwie metody:RFLP i selektywną amplifikację PCR. Strategia metody złożona jest z czterech podstawowych etapów: trawienie totalnego DNA komórkowego z zastosowaniem dwóch racjonalnie dobranych enzymów restrykcyjnych; reakcja ligacji otrzymanych fragmentów z odpowiednio zaprojektowanymi adaptorami; selektywna amplifikacja produktów ligacji z zastosowaniem dwóch starterów homologicznych do sekwencji adaptor-miejsce restrykcyjne; elektroforeza produktów amplifikacji i autoradiografia otrzymanych rozdziałów elektroforetycznych.

58 W odróżnieniu od metod rybotypowania i analizy RFLP produktów PCR, AFLP opiera się na analizie całego genomu bakteryjnego. Zaletami metody AFLP są powtarzalność i wysoki stopień dyskryminacji badanych organizmów. AFLP okazała się niezmiernie przydatnym narzędziem taksonomicznym ze względu na możliwość komputerowej analizy otrzymanych wyników oraz stworzenia na ich podstawie komputerowej bazy danych. Jednakże, AFLP nie jest użyteczna w szybkiej identyfikacji szczepów, ale jest niezmiernie przydatna w studiach dotyczących fundamentalnych pytań odnośnie pokrewieństwa klonalnego szczepów.

59 ...cdn

60

61 Masny, A. and Płucienniczak, A. (2001) Fingerprinting of bacterial genomes by amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites. BioTechniques 31, ADSRRS fingerprinting (ang. Amplification of DNA Surrounding Rare Restriction Sites)

62 1. Krawczyk, B., Lewandowski, K., Bronk, M., Samet, A., Myjak, P., Kur, J.: Evaluation of a novel method based on amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites (ADSRRS fingerprinting) for typing strains of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J. Microbiol. Meth. 52/3 (2003) Krawczyk, B., Naumiuk, Ł., Lewandowski, K., Baraniak, A., Gniadkowski, M., Samet, A., Kur, J.: Evaluation and comparison of random amplification of polymorphic DNA, pulse field gel electrophoresis and amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites methods for typing Serratia marcescens outbreaks. FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2003).

63

64 M2 K - a1 b1 c1 d1 e1 f1 a2 b2 c2 d2 a3 b3 c3 d3 e3 M1 B Outbreak 1 Outbreak 2 Outbreak 3 M2 K - A1 B1 D1 G1 A2 C2D2 A3 B3 D3 A Outbreak 1 Outbreak 2 Outbreak 3 M a1 b1 c1 d1 e1 f1 a2 b2 c2 d2 a3 b3 c3 d3 e3 C Outbreak 1 Outbreaak 2 Outbreak 3

65 Zadaniami na najbliższą przyszłość dla bakteriologii klinicznej wydają się być: (1) wprowadzanie nowych technik mikrobiologicznych i nowych podłóż wybiórczych dla szybkiej identyfikacji bakterii endemicznych (wywołujących zakażenia szpitalne), a także szybkich testów różnicujących z ustaleniem wzorca oporności; (2)stworzenie ośrodków referencyjnych zajmujących się drobnoustrojami mającymi zasadnicze znaczenie w zakażeniach szpitalnych (ustalanie genotypów szczepów endemicznych);

66 (3) wprowadzanie nowych technik mikrobiologicznych służących do bezpośredniego wykrywania drobnoustrojów z materiałów diagnostycznych w rutynowej praktyce (np., PCR); (4) badania technikami genetyki molekularnej izolatów w celu identyfikacji szczepów endemicznych występujących w szpitalu (regionie).

67 Józef Kur Katedra Mikrobiologii Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej, Gdańsk, ul. Narutowicza 11/ Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12. Dziękuję za uwagę. Fili_P


Pobierz ppt "Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display Another way to copy DNA is a technique called polymerase chain."

Podobne prezentacje


Reklamy Google