Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

1 Peptydy Aleksander Kołodziejczyk Gdańsk 2013. 2 Peptydy są to produkty acylowania aminokwasów aminokwasami Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "1 Peptydy Aleksander Kołodziejczyk Gdańsk 2013. 2 Peptydy są to produkty acylowania aminokwasów aminokwasami Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe."— Zapis prezentacji:

1 1 Peptydy Aleksander Kołodziejczyk Gdańsk 2013

2 2 Peptydy są to produkty acylowania aminokwasów aminokwasami Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe pomiędzy aminokwasami

3 3 W zależności od oddalenia od C grup funkcyjnych tworzących wiązanie peptydowe mogą to być wiązania -, -, - i inne. Wiązania - peptydowe powstają pomiędzy grupą -karboksylową i -aminową. Nomenklatura peptydów waliloalanylocysteinyloglicylo- -glutamylo-N -lizyloseryloglicyna Val-Ala-Cys-Gly- -Glu-N -Lys-Ser-Gly VACG- -E- -KSG N-terminalny C-terminalny symbole trójliterowe symbole jednoliterowe

4 4 Val-Ala-GlyH-Val-Ala-Gly-OH cyklopeptydy cyklo(-Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro-) Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe-Pro

5 5 Nagrody Nobla za osiągnięcia związane z peptydami 1902 Emil Fischer badanie cukrów, synteza pierwszych peptydów 1923 Frederick Banting odkrycie insuliny John Maclead 1952 Archer Martin opracowanie chromatografii peptydów, Richard Synge ustalenie budowy gramicydyny 1958 Frederick Sanger ustalenie przestrzennej budowy insuliny Dorothy Hodgkin 1972 Christian Anfinsen ustalenie budowy i wyjaśnienie działania Stanford Moor rybonuleazy, William Stein konstruktorzy analizatora aminokwasów 1955 Vincent du Vigneaud otrzymanie oksytocyny i wazopresyny, pierwszych biologicznie czynnych peptydów 1977 Roger Guillemin badanie hormonów mózgowych Andrew Schally Rosalyn Yalow 1980 Walter Gibert badanie struktury białek i peptydów Frederick Sanger 1984 Robert Merrifield synteza peptydów na fazie stałej

6 6 Peptydy wytwarzane przemysłowo

7 7 Chemiczna synteza peptydów

8 8 Dobra osłona peptydowa powinna: - być łatwa do wprowadzania; - być trwała w takcie syntezy peptydu i jego oczyszczaniu; - zapewniać dobrą rozpuszczalność chronionego AA; - ułatwiać reakcję tworzenia wiązania peptydowego; - utrudniać reakcje uboczne, w tym racemizację; - zapewniać możliwość selektywnego lub/i równoczesnego usuwania wszystkich osłon; - być w 100% łatwo usuwalna Syntetyczna rybonukleaza A, w której usunięto 83% osłon miała jedynie 70% aktywności biologicznej białka natywnego.

9 9

10 10 Osłony grupy aminowej t-butyloksykarbonyl Boc uretan – pochodna kwasu węglowego:

11 11 Osłony grupy karboksylowej (głównie estry): Osłony grupy hydroksylowej: benzyl, t-butyl; acetyl (Ac-); trimetylosilyl – (CH 3 ) 3 Si- Osłony grupy tiolowej: benzyl; acetamidometyl (AcNH-CH 2 -); t-butyl Osłony grupy imidazolowej: benzyl; t-butoksyl; formyl; benzyloksymetyl (Bom- – Bzl-O-CH 2); - tosyl; Fmoc Osłony grupy guanidynowej: nitro (-NO 2 ); tosyl, p-metoksybenzenosulfonyl (Mbs-); benzyloksykarbonyl

12 12 METODY TWORZENIA WIĄZANIA PEPTYDOWEGO Metoda kardodiimidowa (DCC) peptyd częściowo zracemizowany

13 13 Produkt uboczny N-acylomocznik ester aktywny

14 14 Wydajność reakcji = wydajność Ac-Phe-Leu-OMe: 54% Stopień racemizacji E = 11% Reakcja z udziałem soli estru Metoda DCC z dodatkami obniżającymi racemizację

15 15 Metoda mieszanych bezwodników chloromrówczan s-butylu mieszany bezwodnik Metoda aktywnych estrów Aktywne estry: p-nitrofenylowe; pentafluorofenylowe; -OBt; -ONSu Metoda EEDQ N-etoksykarbonylo-2-etoksy-1,2-dihydrochinolina

16 16 Metoda BOP heksafluorofosforantris(dimetyloamino)-1-benzotriazyloksy- fosfoniowy tris(dimetylo)fosforotriamid jest kancerogenny. heksafluorofosforan tris(pirolidyno)- -1-benzotriazoliloksyfosfoniowy heksafluorofosforan bromo- tris(pirolidyno)fosfoniowy tetrafluoroboran [2-(1-benzotriazolo)]- -1,1,3,3-tetrametylouroniowy Niekancerogenne odczynniki kondensujące.

17 17 Metoda azydkowa Metoda azydkowa ma obecnie jedynie historyczne znaczenie. Dawniej uważana za bezracemizacyjną była stosowana do łączenia fragmentów peptydów. Inne metody łączenia fragmentów dawały produkty mocno zracemizowane. W metodzie azydkowej stopień racemizacji osiąga wielkość kilku procent. Racemizacji ulega aminokwas acylujący Stopień racemizacji zależy zarówno od metody stosowanej do utworzenia wiązania peptydowego, jak i właściwości komponentu acylującego; istotną rolę pełni rodzaj osłony grupy aminowej. Osłony uretanowe (Z, Boc, Fmoc) są bezracemizacyjne, tzn. podczas reakcji tworzenia wiązania peptydowego ulegają racemizacji w stopniu poniżej 0,1%.

18 18 Zależność stopnia racemizacji E od konfiguracji reagentów ReakcjaE Z-Leu + Leu-OMe <0,1 Ac-Leu + Leu-OMe40 Ac- D -Leu + Leu-OMe 13 Ac-Leu + Phe-OMe 35 Ac- D -Leu + Phe-OMe 21 CHO-Leu + Leu-OMe 5 CHO- D -Leu + Leu-OMe 4 Z-Gly-Leu + Leu-OMe34 Z-Gly-D-Leu + Leu-OMe 70 AA zawierające osłony acylowe (Ac, Bz, CHO, Pht), a także AA acylowane innym aminokwasem (peptydem) racemizują znacznie podczas acylowania (aktywacji). Stopień racemizacji zależy również od wzajemnej konfiguracji aminokwasów tworzących wiązanie peptydowe.

19 19 Stopień racemizacji jest zależny nie tylko od właściwości reagujących komponentów aminokwasowych i rodzaju aktywacji, ale również od warunków reakcji, czyli rozpuszczalnika, temperatury i czasu reakcji. Synteza peptydów i białek w komórkach jest w 100% bezracemizacyjna.

20 20 Synteza na nośniku stałym - SPPS P = polistyren sieciowany diwinylobenzenem N = nośnik Synteza w roztworze nazywana jest syntezą klasyczną. W 1963 r. B. Merrifield zaproponował nową metodę syntezy peptydów, została ona nazwana syntezą na fazie stałej, SPPS - solid phase peptide synthesis. Synteza peptydów na fazie stałej

21 21 Polimer do SPPS stosowany jest zwykle w postaci kuleczek o średnicy ziarna m Ziarna są porowate i zawierają wiele kanalików. W tych kanalikach rosną łańcuchy syntezowanych peptydów. W ziarnie o średnicy 50 m obsadzonym 0,3 mmola peptydu na 1 g żywicy znajduje się łańcuchów peptydowych. Syntezę peptydów sposobem SPPS prowadzi się obsadzając ziarna żywicy pierwszym aminokwasem zwykle w granicach 0,2-0,7 mmola/g żywicy. Kanaliki muszą mieć odpowiednią średnicę, żeby pomieścić łańcuchy rosnącego peptydu. Przed rozpoczęciem syntezy polimer jest traktowany rozpuszczalnikiem, w którym pęcznieje powiększając rozmiary porów. Żywica Merrifielda (kopolimer styreno-diwinylobenzenowy) pęcznieje pod wpływem dichlorometanu zwiększając dziewięcio- krotnie swoją objętość.

22 22 Zwykle poszczególne operacje na żywicy przeprowadza się w różnych rozpuszczalnikach. Zmianę rozpuszczalnika należy przeprowadzać stopniowo. Synteza peptydu na fazie stałej to operacje jednostkowe powtarzające się cyklicznie.

23 23 Operacje jednostkowe liczba czas [min] A. Przemywanie – przygotowanie do deprotekcji 1. EtOH/AcOH, 1: AcOH 3 1 B. Deprotekcja 3. Wytrząsanie z 1M HCl/AcOH Wytrząsanie z 1M HCl/AcOH 1 15 A. Przemywanie – przygotowanie do neutralizacji 5. AcOH AcOH/EtOH, 1: EtOH EtOH/DCM, 1: DCM 3 1 D. Neutralizacja 10. NEt 3 /DCM NEt 3 /DCM 1 5

24 24 E. Przemywanie – przygotowanie do acylowania 12. DCM 1 1 F. Acylowanie (ang. coupling) 13. Boc-AA (3 eq), DCC. DCM Przemywanie DCM Boc-AA (3 eq), DCC. DCM 1 60 G. Przemywanie – przygotowanie do testu Kaisera 16. DCM DCM/EtOH, 1: EtOH 3 1 H. Test Kaisera 19. Sprawdzenie stopnia acylowania 1 7 Procedura zależy od stosowanych osłon, odczynników sprzęgających, a także od właściwości fizykochemicznych stosowanego nośnika. Nośnik może przypominać peptyd, np. żywica poliamidowa Scheparda W syntezie peptydów na żywicy Scheparda stosuje się osłony Fmoc. Usuwa się je w środowisku zasadowym. Po zakończeniu syntezy peptyd zdejmuje się z nośnika.

25 25 Początkowo największym problemem SPPS była niska czystość peptydu, spowodowana niższą niż 100% wydajnością poszczególnych etapów reakcji, nie tylko acylowania, ale i deprotekcji i neutralizacji. Wydajność poszczególnych etapów reakcji udało się zwiększyć prawie do 100% poprzez stosowanie nadmiaru reagentów, a w razie potrzeby powtarzania etapu. Nadmiar odczynników w metodzie SPPS nie stanowi problemu, ponieważ łatwo je usunąć poprzez odsączenie i przemycie żywicy. Zwykle cena syntezowanego peptydu jest tak wysoka, że koszty nadmiarowych odczynników nie są brane pod uwagę.

26 Peptydy błędne

27 27 Frakcja Średnia wydajność poszczególnych etapów syntezy [%] ,599,9 Udział frakcji po ostatnim etapie syntezy oksytocyny (9-peptydu) 9-peptyd peptydy peptydy 1510,3 Udział frakcji po ostatnim etapie syntezy rybonukleazy (124-peptydu) 124-peptyd peptydy peptydy Skład produktu końcowego w syntezie peptydów metoda SPPS

28 28 Syntezy enzymatyczne

29 29 CT: -chymotrypsyna HO-PEG-OMe: monometylowy eter poli(glikolu etylenowego) CT-O-PEG-OMe: CT kowalencyjnie związana z HO-PEG-OMe t-PenOH: t-pentanol

30 30 Wybrane przykłady zastosowania CT-O-PEG-OMe do syntezy peptydów Składnik acylującyacylowany Czas reakcji [h] Wydajność peptydu Stopień hy- drolizy % Z-PheOEtLeuNH Z-PheOEtLeuNH Z-Phe-OCH 2 CF 3 LeuNH Z-Phe-OCH 2 CF 3 Leu-OMe96815 Z-Phe-OCH 2 CF 3 D -Leu-OMe Boc- D -Phe-Tyr-CamLeuNH Boc-Tyr-Gly-Gly- Phe-NHCH 3 LeuNH

31 31 Synteza LH-RH hormonu uwalniającego hormon luteinizujący luteinizing hormon releasing hormon pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH 2 dekapeptyd pEHWSYGLRPGNH 2 pEHWSY-OMe + GLRPGNH 2 pEHWSYGLRPGNH 2 95%LH-RH 0,10M0,12M

32 32 T: trypsyna CT: chymotrypsyna P: papaina CPD-Y: karbopeptydaza Y CLP: klostrypaina PPSE: specyficzna endoproteaza postprolinowa

33 33 Synteza aspartanu – słodkiego peptydu aspartan Polisynteza Ze względu na duże zapotrzebowanie na peptydy skonstruowano syntezatory peptydów umożliwiające równoczesną syntezę kilkudzie- sięciu, a nawet kilkuset różnych peptydów. Takie operacje prowadzi się np. na prętach pokrytych glikolem polietylenowym lub innym polimerem zdolnym do przyłączenia C-końcowego aminokwasu. Pręty osadzone są w gniazdach bloku, a każde gniazdo zaopatrzone jest w system doprowadzający roztwory odczynników. Wypróbowano też syntezę peptydów w pojemniczkach podobnych do woreczków z herbatą ekspresową; takie woreczki można było w zależności od potrzeb umieszczać w różnych reaktorach.

34 34 Synteza kombinatoryczna – biblioteki peptydów Tym sposobem wyselekcjonowano heksapeptyd: Ac-RRWWCRNH 2 o bardzo wysokiej aktywności przeciwbakteryjnej z pośród mieszaniny zawierającej


Pobierz ppt "1 Peptydy Aleksander Kołodziejczyk Gdańsk 2013. 2 Peptydy są to produkty acylowania aminokwasów aminokwasami Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe."

Podobne prezentacje


Reklamy Google