Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko Biblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko Biblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius."— Zapis prezentacji:

1 Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko Biblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius Lupinus angustifolius

2 Konstrukcja biblioteki BAC dla genomu Lupinus angustifolius Charakterystyka biblioteki – czystość, średnia wielkość insertu, reprezentatywność Wykorzystanie biblioteki – przeszukiwanie sondami EST, chromosome painting, chromosome walking Cel pracy

3 Materiały DNA Lupinus angustifolius, izolowany z jąder interfazowych stożków wzrostu korzeni, oczyszczony metodą cytometrii przepływowej Enzym restrykcyjny HindIII Wektor pINDIGOBAC5 (Epicentre) Komórki kompetentne E. coli DH10B Medium selekcyjne ( CHl, X-Gal, IPTG ) Płytki do przechowywania klonów w temperaturze -80 o C, 384-miejscowe

4 1. Izolacja DNA za pomocą sortera chromosomów

5 2. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C) 3. Selekcja wielkości fragmentów po trawieniu PFGE: Podwójna selekcja wielkości (w buforze x TBE) Pierwsza selekcja: 1% żel agarozowy, 1s - 40s, 6h, 6V/cm, kąt 120° Druga selekcja: 1% żel agarozowy, 2.5s - 4.5s, 12h, 6V/cm, kąt 120°

6 4. Elektroelucja (1,5 h, 1xTAE, 4 V/cm, 4 o C) 5. Ligacja z wektorem pIndigoBAC-5 (Epicentre)

7 6. Transformacja E. coli DH10B (350 V, impuls 4000, 330 F) 7. Selekcja klonów na podłożu stałym z chloramfenikolem, X- gal, IPTG Płyta typu BioAssay z transformowanymi komórkami bakteryjnymi

8 8. Pikowanie i inokulacja (GeneTAC G3)

9 9. Sprawdzenie średniej długości insertów - trawienie BACów enzymem NotI - elektroforeza w pulsującym polu (1% żel agarozowy, 0,5xTBE, 1s - 40s, 16h, 6V/cm, kąt 120°)

10 Dystrybucja wielkości insertów Długość insertu [kbp] Procentowy udział w bibliotece

11 Obliczanie prawdopodobieństwa znalezienia dowolnie wybranej sekwencji nukleotydowej genu w bibliotece BAC - wzór Clarkea i Carbona P - prawdopodobieństwo, że dowolna sekwencja genomowa ma odpowiednik w bibliotece N - liczba klonów (55 296) x - średnia długość insertu (100 kpz) y - wielkość genomu (920 Mpz)

12 10. Test czystości biblioteki – hybrydyzacja z sondami specyficznymi dla mtDNA i cpDNA łubinu Przykładowa hybrydyzacja z sondą mtDNA Klucz odczytywania sygnałów Dwa pozytywne sygnały na klony BAC

13 11. Screening biblioteki sondami EST znakowanymi radioaktywnie – poszukiwanie genu ENOD Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego klonu BAC

14 Podsumowanie Skonstruowano pierwszą bibliotekę BAC dla genomu Lupinus angustifolius Charakterystyka biblioteki: - liczba klonów: średnia wielkość insertu: 100 kbp - zanieczyszczenie mtDNA: 0,018% - zanieczyszczenie cpDNA: 0,045% - prawdopodobieństwo znalezienia sekwencji: 99,7% - pokrycie: 6x


Pobierz ppt "Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko Biblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius."

Podobne prezentacje


Reklamy Google