Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska,

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska,"— Zapis prezentacji:

1 Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska, Berlin, Niemcy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

2 Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnym EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality ADENOVIRUS NOROVIRUS ROTAVIRUS Spożycie (z płynami) Wdychanie i aspiracja (z aerozolami) Kontakt (podczas mycia) Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne) Żołądkowo-jelitowa Oddechowa Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp. Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni* ADENOWIRUS NOROWIRUS ROTAWIRUS

3 Ocena ryzyka *Podstawy naukowe Zarządzanie ryzykiem *Zgodnie z polityką Komunikowanie ryzyka *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka Źródło: WHO Food Safety EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Struktura ramowa analizy ryzyka odpowiednie metody

4 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dzisiaj nie będę mówić o… Liczba kolonii DIN EN ISO 6222 E. coli DIN EN ISO DIN EN ISO DIN EN ISO Enterococci DIN EN ISO DIN EN ISO DIN EN ISO Pseudomonas DIN EN aeruginosa Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach... ale raczej o: starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii (wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody, badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…)

5 - badania liczebności i zakaźności bakteriofagów DNA i RNA - pobieranie próbek wody do analizy wirusów - oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu filtra z włókna szklanego - ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa - rola inhibitorów środowiskowych - wykrywanie wirusów metodami PCR - badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Phage MS2

6 Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagów Fagi somatyczne DIN EN ISO :2001 Fagi F+RNA DIN EN ISO :2001 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Fagi F+RNA F-Pilus Fagi somatyczne Bacterium Fagi B. fragilis DIN EN ISO :2001 F+

7 Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowym EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

8 Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody Fagi F+RNA Fagi somatyczne DIN Szczep Salmonella thyphim. E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC ) lub ( WG5; ATCC ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC ) Dolny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar Modif. Scholtens Agar (TYGA) ( MSA ) Górny agar: ssTYGA (0,8% agar) ssMSA (0,8% agar) Kwas nalidyksowy:100 µg/ml 250 µg/ml Granica wykrywalności: 1 pfu/50 ml 1 pfu/50 ml Fag wzorcowy: MS2 PhiX EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

9 MS2 Fag138 PhiX174 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka PRD1 Morfologia płytek bakteriofagów

10 Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych: zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii Morfologia płytek bakteriofagów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka C.Fuchs

11 Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Karta przewodnia Kolifag somatyczny PhiX 174 Ar + Bri Data pfu / ml x-3sx-2sxx+2sx+3s Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml

12 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Monitorowanie wirusów – pobieranie prób Związki chemiczne Wirusy Rozkład statystyczny Skupiska!

13 Próbobranie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

14 Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej próbka wody surowej 100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii ( DNA / RNA ) Infectivity assays Wykrywanie wirusa metodą PCR 10-litrowa próba wody 1.Pobieranie prób wody o dużej objętości 2.Zmniejszenie objętości próbek (1:1000) 3.Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów 4.Testy wykrywające wirusy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

15 Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody Cechy wirusaMetody Polarność powierzchniowa kapsydu Adsorpcja / Wymywanie Rozmiar cząsteczki Filtracja membranowa (Ultrafiltracja) Gęstość Ultrawirowanie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

16 Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanego

17 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka W terenie…

18 Włókno szklane – badania polowe dużych objętości Próba wody: 10 litrów 1000 litrów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

19 Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiska

20 liza etapy mycia elucja kroki powtarzane 5 razy Próbka 5ml Bufor do lizy Krzemionka 2x 50 µl Bufor do elucji 5 min 60°,1400 rpm EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oczyszczanie DNA i RNA

21 Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludzi Zdjęcia: dzięki uprzejmości J.Y. Scro Wirus DNA Wirus RNA EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

22 5---CTCAGCGTTACCAT GAGTCGCAATGGTA CUCAGCGUUACCAU---3 N---Leu-Ser-Val-Thr---C DNA RNA BIAŁKO Transkrypcja Translacja DNA RNA Białko Amplifikacja informacji genetycznej wirusów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Odwrotna transkrypcja

23 Wykrywanie wirusów metodami PCR konwencjonalne PCR (jakościowe) PCR czasu rzeczywistego (ilościowe) DNA / RNA EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

24 Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

25 NOROWIRUS (nested RT-PCR) ADENOWIRUS (nested PCR) WZW A WIRUS (nested RT-PCR) (Mediagnost R ) Nested (RT)-PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

26 Real-Time TaqMan TM PCR - Potrzebne są tylko: (1) matryca (próbka DNA) (2) nieoznaczona para dla starterów (3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana 2 fluorochromami (np. reporter FAM i wygaszacz TAMRA) (4) Mastermix (koktail odczynników) Łączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu Adenowirus 41 wzorzec kopii EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

27 1. 5 µl próbka 2. 5 µl próbka + Ad Wzorzec µl próbka µl próbka 1:10 Testy / próbki: Real-time PCR Na amplifikację kwasów nukleinowych z próbek pobranych ze środowiska często negatywnie wpływa obecność inhibitorów. Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych

28 Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR Integrated Cell Culture PCR (ICC-PCR) Badanie zakaźności adenowirusa EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka (A. Heim)

29 Metody wykrywania wirusa O zwiększonej czułości Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli Wykrywa jedynie żywe organizmy Wykrywa zakaźnego wirusa Skraca czas wykrywania ICC-PCRRT-PCR Hodowla komórkowa Metoda wykrywania Odporna na wpływ substancji hamujących PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

30 a) Test TCID 50 b) Test łysinkowy Badanie zakaźności enterowirusa kontrolna CVB3 Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

31 Podstawowe techniki monitorowania wirusów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Techniki zaawansowane: - wydajna metoda koncentracji wirusów - skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA -systemy PCR dopasowane do wirusów ( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR ) -systemy hodowli komórkowych do badania zakaźności - Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa

32 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dziękuję Państwu!


Pobierz ppt "Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska,"

Podobne prezentacje


Reklamy Google