Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska,

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska,"— Zapis prezentacji:

1 Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska, Berlin, Niemcy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

2 Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnym EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality ADENOVIRUS NOROVIRUS ROTAVIRUS Spożycie (z płynami) Wdychanie i aspiracja (z aerozolami) Kontakt (podczas mycia) Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne) Żołądkowo-jelitowa Oddechowa Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp. Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni* ADENOWIRUS NOROWIRUS ROTAWIRUS

3 Ocena ryzyka *Podstawy naukowe Zarządzanie ryzykiem *Zgodnie z polityką Komunikowanie ryzyka *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka Źródło: WHO Food Safety EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Struktura ramowa analizy ryzyka odpowiednie metody

4 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dzisiaj nie będę mówić o… Liczba kolonii DIN EN ISO 6222 E. coli DIN EN ISO 9308-1 DIN EN ISO 9308-3 DIN EN ISO 9308-1 Enterococci DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 DIN EN ISO 7899-2 Pseudomonas DIN EN 12780 aeruginosa Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach... ale raczej o: starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii (wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody, badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…)

5 - badania liczebności i zakaźności bakteriofagów DNA i RNA - pobieranie próbek wody do analizy wirusów - oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu filtra z włókna szklanego - ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa - rola inhibitorów środowiskowych - wykrywanie wirusów metodami PCR - badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Phage MS2

6 Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagów Fagi somatyczne DIN EN ISO 10705-2:2001 Fagi F+RNA DIN EN ISO 10705-1:2001 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Fagi F+RNA F-Pilus Fagi somatyczne Bacterium Fagi B. fragilis DIN EN ISO 10705-4:2001 F+

7 Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowym EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

8 Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Fagi F+RNA Fagi somatyczne DIN 10705-1 10705-02 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Szczep Salmonella thyphim. E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC 12484 ) lub ( WG5; ATCC 700078 ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC 23631 ) Dolny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar Modif. Scholtens Agar (TYGA) ( MSA ) Górny agar: ssTYGA (0,8% agar) ssMSA (0,8% agar) Kwas nalidyksowy:100 µg/ml 250 µg/ml Granica wykrywalności: 1 pfu/50 ml 1 pfu/50 ml Fag wzorcowy: MS2 PhiX174 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

9 MS2 Fag138 PhiX174 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka PRD1 Morfologia płytek bakteriofagów

10 Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych: zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii Morfologia płytek bakteriofagów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka C.Fuchs

11 Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Karta przewodnia Kolifag somatyczny PhiX 174 Ar + Bri 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 20.4.08 10.5.08 30.5.0819.6.08 9.7.08 29.7.0818.8.08 7.9.08 27.9.08 17.10.08 6.11.08 26.11.0816.12.08 Data pfu / ml x-3sx-2sxx+2sx+3s Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml

12 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Monitorowanie wirusów – pobieranie prób Związki chemiczne Wirusy Rozkład statystyczny Skupiska!

13 Próbobranie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

14 Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej próbka wody surowej 100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii ( DNA / RNA ) Infectivity assays Wykrywanie wirusa metodą PCR 10-litrowa próba wody 1.Pobieranie prób wody o dużej objętości 2.Zmniejszenie objętości próbek (1:1000) 3.Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów 4.Testy wykrywające wirusy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

15 Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody Cechy wirusaMetody Polarność powierzchniowa kapsydu Adsorpcja / Wymywanie Rozmiar cząsteczki Filtracja membranowa (Ultrafiltracja) Gęstość Ultrawirowanie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

16 Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanego

17 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka W terenie…

18 Włókno szklane – badania polowe dużych objętości Próba wody: 10 litrów 1000 litrów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

19 Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiska

20 liza etapy mycia elucja kroki powtarzane 5 razy Próbka 5ml Bufor do lizy Krzemionka 2x 50 µl Bufor do elucji 5 min 60°,1400 rpm EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oczyszczanie DNA i RNA

21 Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludzi Zdjęcia: dzięki uprzejmości J.Y. Scro Wirus DNA Wirus RNA EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

22 5---CTCAGCGTTACCAT---3 3---GAGTCGCAATGGTA---5 5---CUCAGCGUUACCAU---3 N---Leu-Ser-Val-Thr---C DNA RNA BIAŁKO Transkrypcja Translacja DNA RNA Białko Amplifikacja informacji genetycznej wirusów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Odwrotna transkrypcja

23 Wykrywanie wirusów metodami PCR konwencjonalne PCR (jakościowe) PCR czasu rzeczywistego (ilościowe) DNA / RNA EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

24 Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

25 NOROWIRUS (nested RT-PCR) ADENOWIRUS (nested PCR) WZW A WIRUS (nested RT-PCR) (Mediagnost R ) Nested (RT)-PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

26 Real-Time TaqMan TM PCR - Potrzebne są tylko: (1) matryca (próbka DNA) (2) nieoznaczona para dla starterów (3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana 2 fluorochromami (np. reporter FAM i wygaszacz TAMRA) (4) Mastermix (koktail odczynników) Łączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu Adenowirus 41 wzorzec 10 2 - 10 6 kopii EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

27 1. 5 µl próbka 2. 5 µl próbka + Ad Wzorzec 3. 10 µl próbka 4. 10 µl próbka 1:10 Testy / próbki: Real-time PCR Na amplifikację kwasów nukleinowych z próbek pobranych ze środowiska często negatywnie wpływa obecność inhibitorów. Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych

28 Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR Integrated Cell Culture PCR (ICC-PCR) Badanie zakaźności adenowirusa EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka (A. Heim)

29 Metody wykrywania wirusa O zwiększonej czułości Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli Wykrywa jedynie żywe organizmy Wykrywa zakaźnego wirusa Skraca czas wykrywania ICC-PCRRT-PCR Hodowla komórkowa Metoda wykrywania Odporna na wpływ substancji hamujących PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

30 a) Test TCID 50 b) Test łysinkowy Badanie zakaźności enterowirusa kontrolna CVB3 Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

31 Podstawowe techniki monitorowania wirusów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Techniki zaawansowane: - wydajna metoda koncentracji wirusów - skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA -systemy PCR dopasowane do wirusów ( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR ) -systemy hodowli komórkowych do badania zakaźności - Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa

32 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dziękuję Państwu!


Pobierz ppt "Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska,"

Podobne prezentacje


Reklamy Google