Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Anna Kropiwnicka dr Joanna Żuberek

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Anna Kropiwnicka dr Joanna Żuberek"— Zapis prezentacji:

1 Anna Kropiwnicka dr Joanna Żuberek
Czynniki inicjujące translację – determinanty oporności roślin na wirusy z rodziny Potyviridae Anna Kropiwnicka dr Joanna Żuberek Zakład Biofizyki, IFD UW 1

2 Inicjacja translacji u Eukaryota
eIF4F = eIF4E + eIF4G eIF4E wiąże kap eIF4G rusztowanie, oddziałuje z innymi faktorami: polyA binding protein (PABP) eIF4A - DEAD box helikaza – rozplatanie struktury II-rz eIF3 – wieloskładnikowy kompleks, wiąże podjednostkę 40S rybosomu Po związaniu mRNA do podjednostki 40S – skanowanie przez 40S, eIF2–met–tRNA–GTP, eIF1, eIF1A do kodonu start Przyłączenie podjednostki 60S -> kompleks 80S Hydroliza GTP i uwolnienie faktorów Badania u różnych organizmów - istnienie więcej niż pojedynczych izoform tworzących kompleks 4F -> wiele izoform 4E Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 2

3 Roślinny kompleks inicjujący translację
Arabidopsis thaliana: eIF4E i eIF(iso)4E ~50% podobieństwa w sekwencji aa ~24 kDa eIF4G kDa eIF(iso)4G - 86 kDa eIF4F i eIF(iso)4F Podobna aktywność przeprowadzania translacji in-vitro eIF(iso)4F preferuje hipermetylowane kapy i mRNA mniej ustrukturyzowane eIF4F bardziej wydajny w prowadzeniu translacji niezależnej od kapu (RNA ustrukturyzowane i z wewnętrznymi miejscami inicjacji) oraz w warunkach inhibicji translacji zależnej od kapu eIF4E wszędzie poza specyficznymi rejonami korzenia eIF(iso)4E głównie młode, rozwijające się tkanki i kwiaty (4E w korzeniu: ekspresja w merystemie wierzch i strefie wzrostu, brak w rejonie specjalizacji, czapeczce i QC) iso4G znacznie skrócone na N-końcu w porównaniu z 4G Moja praca mgr Warunki inhibicji – np. infekcja wirusowa Wirusy – bezwzględne pasożyty, metafora o hijacking Wśród roślin potywirusów najwięcej Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 3

4 Potywirusy – postrach roślin
Rodzaj Potyvirus jest największy wśród wirusów roślinnych To ok. 30% wszystkich znanych wirusów roślinnych Najbardziej powszechne i niszczycielskie Duże straty w rolnictwie – atakują wiele ważnych roślin uprawnych Nawet 50% straty w zimowej produkcji jęczmienia w Europie i Wschodniej Azji z powodu: Barley yellow mosaic virus Barley mild mosaic virus Potywirusy należą do rodziny Potyviridae Zakład Biofizyki, IFD UW 4

5 Wirusy z rodziny Potyviridae
Genom - jednoniciowe RNA o dodatniej polarności (ok. 10 kb) Należą trzy rodzaje: Potyvirus i Rymovirus - jeden segment RNA Bymovirus - genom podzielony na dwa segmenty VPg (viral genome-linked protein) kowalencyjnie związane z `-końcem RNA Każdy segment koduje jedną poliproteinę Wycinanie z poliproteiny przynajmniej 8 dojrzałych białek przez wirusowe proteazy Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Potyvirusy – 10 dojrzalych bialek Wycinanie przez 3 proteazy. Tak VPg wycinane Zakład Biofizyki, IFD UW 5

6 Potywirusowe VPg ~25 kDa Prekursor NIa:
N – VPg wewnętrzne miejsce cięcia proteaza C VPg wiąże się kowalencyjnie (przez Tyr) do nowo syntetyzowanego RNA Rola w cyklu życiowym potywirusa: Oddziaływanie z wirusową polimerazą RNA -> replikacja Akumulacja w jądrze -> replikacja? Oddziaływanie z eIF4E lub eIF(iso)4E warunkuje zajście infekcji wirusowej Rola VPg mało znana VPg kilku wirusów wiążę izoformy 4E (drożdżowy system dwuhybrydowy i in-vitro) Zaburzenie oddziaływania (in vitro) przez mutacje nie pozwala zajść infekcji Oddziaływanie z 4E warunkuje zajście infekcji Zakład Biofizyki, IFD UW 6

7 Postulowane funkcje izoform eIF4E podczas infekcji
Oddziaływanie VPg-eIF4E ułatwia translację niezależną od kapu Utworzenie ciasnej pętli Inhibicja eIF4E-zależnej translacji w komórce -> uwolnienie rybosomów Ruch z komórki do komórki Replikacja genomu Stabilność wirusowego RNA Dreher et al. (2006) Virology 344, 185 Mało wiemy IRES i udawanie kapu DCP-like dekapping; XRN-like egzonukleaza Znaleziono takie –like, ale nie wiadomo czy rzeczywiście taka funkcja 4G wiążę MT i ma domenę kinezyno-podobną Funkcja ważna, bo że zaburzenie skutkuje w awirulentości danego potywirusa Lellis et al. (2002) Current Biol. 12, 1046 Utworzenie ciasnej pętli podczas inicjacji replikacji Urydylowane VPg primerem Zakład Biofizyki, IFD UW 7

8 Oporność roślin Zaburzone oddziaływanie VPg-izoforma eIF4E uniemożliwia rozwój infekcji potywirusowej -> roślina uzyskuje oporność Oporność recesywna – nieadekwatność lub brak czynnika wymaganego w cyklu życiowym wirusa Geny oporności o charakterze dominującym - odpowiedź nadwrażliwości na infekcję (gen-za-gen) Wiele naturalnych genów oporności na potywirusy Ponad połowa ma charakter recesywny i stanowi ok. 40% wszystkich znanych recesywnych genów oporności Znaczna część to zmutowane czynniki inicjujące translację, szczególnie izoformy eIF4E Recesywna lub dominująca bo zgodnie z kryterium dziedziczenia. Jesteśmy diploidalni Recesywne -> inhibicja 4E-zależnej translacji poprzez zabieranie 4E należy odrzucić, bo to miałoby naturę dominującego genu Zakład Biofizyki, IFD UW 8

9 Recesywne geny oporności na wirusy Potyviridae
Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E TEV pvr1, pvr22 PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E PVY, TEV Pomidor pot-1 PSbMV Groch sbm1, sbm4 LMV Sałata mo11, mo12 CIYVV A.thaliana *eIF4E1 TuMV, LMV, TEV, PPV lsp1, *eIF(iso)4E *eIF4G LMV, PPV *eIF(iso)4G1 TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2 Bymovirus BaYMV, BaMMV Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 Najwięcej dla potyvirusów Geny naturalne – najwięcej wiemy o pieprzu. Dużo genów w grochu i jęczmieniu, ale powiązanych z eIF 2 i 4 Mutanty A.th. (org modelowy) – knock-outy 1-liść i 2-liść Naturalne geny – mutacje punktowe Struktura - pszenica Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 9

10 Monzingo et al. (2007) Plant Physiol. 143, 1504
eIF4E pszenicy Mutacje związane z opornością: Pieprz Pomidor Groch Sałata Jęczmień Wspólne Domena wiążąca eIF4G Struktura b. podobna do struktur dla innych organizmów. Naniesione położenia mutacji Mutacje aa nie zachowywanych, Nie wpływają na ogólny fold (na powierzchni) Mutacje pokazują regiony oddziaływania z VPg Region wokół kieszeni wiążącej kap i region obrócony o 90º względem kieszeni -> 2 miejsca wiązania VPg Część wiążę kap, część nie 4E sałaty może jednocześnie związać i m7GDP i LMV VPg, ale wiązanie jednego zmniejsza powinowactwo do drugiego -> Częściowe pokrycie się regionu oddziaływania z kapem i VPg Pojedyncze mutacje wystarczają (sałata) i różne pozycje dla różnych wirusów -> precyzyjne kontakty optymalizowane dla danej pary Monzingo et al. (2007) Plant Physiol. 143, 1504 Zakład Biofizyki, IFD UW 10

11 Interakcja VPg-eIF4E Dwa miejsca oddziaływania VPg z eIF4E
Region wokół kieszeni wiążącej kap Region obrócony o 90º względem domeny wiążącej kap Częściowe pokrycie się strefy interakcji eIF4E-kap z rejonem oddziaływania eIF4E-VPg Precyzyjne kontakty optymalizowane dla danej pary VPg/eIF4E Zdolność wirusów do przełamywania oporności Koewolucja między gospodarzem pragnącym uniemożliwić wiązanie eIF4E-VPg a potywirusem usiłującym ten kontakt odzyskać Zmiany w centralnej części VPg Wyścig zbrojeń Zakład Biofizyki, IFD UW 11

12 Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40
Pieprz (Capsicum spp.) Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E TEV pvr1, pvr22 PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E PVY, TEV Pomidor pot-1 PSbMV Groch sbm1, sbm4 LMV Sałata mo11, mo12 CIYVV A.thaliana *eIF4E1 TuMV, LMV, TEV, PPV lsp1, *eIF(iso)4E *eIF4G LMV, PPV *eIF(iso)4G1 TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2 Bymovirus BaYMV, BaMMV Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 Potato virus Y (PVY) powszechny na większości terenów uprawnych Tobacco etch virus (TEV) Ameryka płn i centr., Karaiby Geny oporności dość pospolite – 40% odmian opornych na powszechne odmiany PVY pvr2 używany od ponad 50 lat, stabilna i efektywna oporność Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 12

13 pvr1, pvr21, pvr22 Allele tego samego genu kodującego eIF4E
pvr1 – C. chinese pvr2 – C. annuum Przemianowanie pvr21 na pvr11 itd. Oporność na Potato virus Y (PVY) i Tobacco etch virus (TEV) Substytucje w allelach PVY-0 PVY-0,1 TEV pvr1 R nd pvr21 S pvr22 pvr – potyvirus virus resistance Pvr21 generalnie wrażliwy na TEV, ale łagodniejsze objawy spowolnione systemiczne objawy i akumulacja wirusa Systematyczny atak – w końcu pełen rozwój infekcjii Yeam et al. (2007) Plant Cell 19, 2913 Zakład Biofizyki, IFD UW 13

14 Mutanty z pojedynczymi substytucjami
Zbadanie oddziaływania in-vitro z VPg różnych szczepów TEV i wiązania kapu Brak oddziaływania pojedynczego mutanta G107R z VPg potwierdzony in-vivo Substytucja G107R odpowiedzialna za oporność na TEV T51A i P66T negatywnie wpływają na efekt uzyskany przez G107R pvr1 + pvr22 – oporność na wszystkie cztery szczepy TEV HAT NW N Mex21 kap pvr1 R S pvr21 + / – pvr22 T51A + P66T G107R V67E L79R D109N Yeam et al. (2007) Plant Cell 19, 2913 VPg - drożdżowy system dwuhybrydowy Kap – pull-down assay Zakład Biofizyki, IFD UW 14

15 pvr1, pvr21 – pvr29 Identyfikacja dodatkowych alleli pvr2
Koewolucja między szczepami TEV i PVY a Capsicum spp. Znacznie więcej miejsc polimorficznych w sekwencjach kodujących niż w intronach Przełamywanie oporności poprzez odzyskanie kontaktu ze zmutowanymi eIF4E, a nie z innymi izoformami 51 66 67 68 73 74 79 107 109 205 PVY-0 PVY-O,1,2 TEV-HAT TEV-CAA10 pvr2+ T P V A L G D S pvr21 E R pvr22 R/L N pvr23 pvr24 pvr25 pvr26 pvr27 pvr28 pvr29 pvr1 nd Jak oznaczam wt + G107R daje oporność na TEV-HAT, ale +A68E (pvr28) wraca wrażliwość i oddziaływanie z VPg -> kompensacja? pvr24 – pojedyncza mutacja, wystarcza -> precyzyjny kontakt Wiążą kap, pvr21 i 22 słabiej pvr1 i mutant G107R nie wiążą kapu Zakład Biofizyki, IFD UW 15

16 pvr22 + pvr6 C. annuum pvr22 koduje funkcjonalne eIF4E (V67E, L79R i D109N) pvr6 koduje niefunkcjonalne eIF(iso)4E Delecja w I egzonie (89-107)bp -> kodon stop po 51 aa Dodatkowo substytucje G268A, C483A i C537T aa z zachowywanych aa na N-końcu (Białko niezmutowane aa) Brak residuów kluczowych dla wiązania kapu (m.in. ośmiu Trp) Oporność na Pepper veinal mottle virus (PVMV): pvr2 – wrażliwy pvr6 – wrażliwy pvr22 + pvr6 – oporny PVMV może zamiennie wykorzystywać eIF4E i eIF(iso)4E Fenotyp roślin normalny -> Izoforma kodowana przez pvr6+ nie jest niezbędna do prawidłowego rozwoju pvr6 prawdopodobnie nie jest oporny na żadnego potywirusa fenotyp <- we wzroście, rozwoju, w plonach Zakład Biofizyki, IFD UW 16

17 Pomidor (Lycopersicon spp.)
Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E TEV pvr1, pvr22 PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E PVY, TEV Pomidor pot-1 PSbMV Groch sbm1, sbm4 LMV Sałata mo11, mo12 CIYVV A.thaliana *eIF4E1 TuMV, LMV, TEV, PPV lsp1, *eIF(iso)4E *eIF4G LMV, PPV *eIF(iso)4G1 TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2 Bymovirus BaYMV, BaMMV Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 Pomidor i pieprz – ta sama rodzina Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 17

18 Ruffel et al. (2005) Mol Gen Genomics 274, 346
pot-1 pot-1 ortologiem pvr2 Ta sama lokalizacja genomowa 86,6% identyczność sekwencji aa Oporność na PVY i TEV Koduje eIF4E Substytucje: L48F, N68K, A77D i M109I Położenia mutacji powiązanych z opornością: pvr2, mo1, sbm1 Ortologia – homologia i to samo loci R na powszechne szczepy PVY i TEV W podobnych rejonach mutacje Ruffel et al. (2005) Mol Gen Genomics 274, 346 Zakład Biofizyki, IFD UW 18

19 Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40
Groch (Pisum sativum) Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E TEV pvr1, pvr22 PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E PVY, TEV Pomidor pot-1 PSbMV Groch sbm1, sbm4 LMV Sałata mo11, mo12 CIYVV A.thaliana *eIF4E1 TuMV, LMV, TEV, PPV lsp1, *eIF(iso)4E *eIF4G LMV, PPV *eIF(iso)4G1 TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2 Bymovirus BaYMV, BaMMV Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 19

20 sbm1 i sbm4 Allele tego samego genu kodującego eIF4E
Przemianowanie sbm4 na sbm11 Oporność na Pea seed-borne mosaic virus (PSbMV): sbm1 – oporny na PSbMV-P1, sbm4 – oporny na PSbMV-P4 Mutacje w allelach: sbm1 W6L A73D A74D – G107R N169K sbm11 – A73P A74D S77Δ – – Położenia mutacji powiązanych z opornością: pvr2 – kółka, mo1 – trójkąty PSbMV wykorzystuje produkt sbm1+ przy multiplikacji i przemieszczaniu z komórki do komórki sbm1 – zapewne zablokowana replikacja, ale ruch z komórki do komórki obecny sbm11 – zapewne zablokowana multiplikacja, nie wiadomo czy jest przemieszczanie sbm1 sbm11 sbm1+ PSbMV-P1 – patotyp 1 sbm1 nie wiąże kapu in-vitro -> Trp75 Transport: Gln72 odpowiada S53 z ludzkiego 4E S53A -> utrata zdolności do transportu mRNA cykliny D1 do cytoplazmy Nie widać oddziaływania VPg-4E in-vitro Może inne czynniki potrzebne Gao et al. (2004) Plant J 40, 376 Zakład Biofizyki, IFD UW 20

21 Jęczmień (Hordeum vulgare)
Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E TEV pvr1, pvr22 PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E PVY, TEV Pomidor pot-1 PSbMV Groch sbm1, sbm4 LMV Sałata mo11, mo12 CIYVV A.thaliana *eIF4E1 TuMV, LMV, TEV, PPV lsp1, *eIF(iso)4E *eIF4G LMV, PPV *eIF(iso)4G1 TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2 Bymovirus BaYMV, BaMMV Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 Barley yellow mosaic virus (BaYMV) Barley mild mosaic virus (BaMMV) Zakres gospodarzy wąski, kilka jednoliść – gł. pszenica, jęczmień, ryż Przenoszone przez Polymyxa graminis wszechobecny w glebie do głębokości 60 cm -> chemiczna ochrona nieekonomiczna i niepraktyczna ->> b. powszechne stosowanie gatunków opornych Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 21

22 Monzingo et al. (2007) Plant Physiol. 143, 1504
rym4, rym5, rym6, eif4e1 Allele tego samego genu kodującego eIF4E Oporność na Barley yellow mosaic virus (BaYMV) i Barley mild mosaic virus (BaMMV) Podobne strategie przeciwko Potyviridae u jednoliściennych i u dwuliściennych Mutacje eIF4E jako stare ewolucyjnie geny oporności na wirusy 52 53 57 109 118 120 160 161 205 206 wt N P S E K T Q D rym4 F T / I / F G rym5 rym6 H eif4e1 Mutacje związane z opornością: Pieprz Pomidor Groch Sałata Jęczmień Wspólne rym – resistance to yellow mosaic rym4 - różnice w zależności czy europejska czy azjatycka odmiana eif4e1 – EMS induced Podobne regiony oddziaływania z VPg Monzingo et al. (2007) Plant Physiol. 143, 1504 Zakład Biofizyki, IFD UW 22

23 Rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana)
Rodzaj Wirus Roślina Gen / *Mutant eIF Potyvirus PVY Pieprz pvr1, pvr21-pvr29 4E TEV pvr1, pvr22 PVMV pvr22 + pvr6 4E+(iso)4E PVY, TEV Pomidor pot-1 PSbMV Groch sbm1, sbm4 LMV Sałata mo11, mo12 CIYVV A.thaliana *eIF4E1 TuMV, LMV, TEV, PPV lsp1, *eIF(iso)4E *eIF4G LMV, PPV *eIF(iso)4G1 TuMV, PPV *eIF(iso)4G1 + *eIF(iso)4G2 Bymovirus BaYMV, BaMMV Jęczmień rym4-rym6, eif4e1 Org modelowy, genom zsekwencjonowany Badania typu knock-out -> insercje i mutacje EMS-indukowane Robaglia et al. (2006) Trends Plant Sci. 11, 40 Zakład Biofizyki, IFD UW 23

24 Mutanty A. thaliana Null allele eIF4E1 Null allele eIF(iso)4E
-cum1-1 – EMS-zaindukowany stop kodon w I egzonie -T-DNA insercja w I intronie Null allele eIF(iso)4E -AteIF(iso)4E-1 – insercja tranpozonu Spm w II egzon -lsp1-1 – EMS-zaindukowany stop kodon w I egzonie (kodon 63) -lsp1-2 – EMS-zaindukowany stop kodon w II egzonie (kodon 120) -lsp1-3 – EMS-zaindukowany stop kodon w II egzonie (kodon 120) i punktowa mutacja w I intronie Null allele izoform eIF4G Pojedyncze T-DNA insercje w geny: AteIF4G, AteIF(iso)4G1 i AteIF(iso)4G2 Sato et al. (2005) FEBS Letters 579, 1167 Null – niefunkcjonalne bo np stop kodon Insercja duża (T-DNA, transposon) Lellis et al. (2002) Current Biol 12, 1046 Zakład Biofizyki, IFD UW 24

25 Mutanty A. thaliana Wrażliwość na potywirusy
TEV-Tobacco etch virus PPV-Plum pox virus LMV-Lettuce mosaic virus CIYVV-Clover yellow vein virus TuMV-Turnip mosaic virus Potywirusy preferują kompleksy eIF4E-eIF4G, które naturalnie tworzą eIF4F w komórce TuMV VPg może wymiennie oddziaływać z obiema izoformami eIF(iso)4G TEV PPV LMV CIYVV TuMV wt S eIF4E1 nd R eIF(iso)4E eIF4G eIF(iso)4G1 eIF(iso)4G2 eIF4G + eIF(iso)4G1 eIF4G + eIF(iso)4G2 Brak – mutacja letalna? eIF(iso)4G1 + eIF(iso)4G2 Parami 4E+4G i iso4E+iso4G -> używają komleksów 4F, co naturalnie w komórce TuMV może wymiennie używać obu isoG Brak eIF(iso)4E mRNA i samego białka, a poziom białka 4E wyższy niż w wt (bez zmiany poziomu AteIF4E1 mRNA) Wytłumaczenia hipotetyczne: eIF4F bardziej wydajne eIF4E wydajniejsze w wiązaniu swego mRNA eIF4E/eIF(iso)4G Knock-out 4E daje fenotypowo mniejsze rośliny. Zakład Biofizyki, IFD UW 25

26 Nie tylko rośliny... Calicivirus
Ludzki wirus Norwalk (NV) i wirus Lorsdale, koci Feline calicivirus (FCV), mysi Murine norovirus (MNV) i inne Główna przyczyna pozabakteryjnych epidemicznych zapaleń żołądka i jelit na świecie (~85%) Zwierzęta – zaburzenia oddechowe, krwotoki, „koci katar” Genom – RNA o dodatniej polarności, 7-8 kb Poliadenylowane i kowalencyjnie związane z VPg (12-13 kDa) Brak kapu i brak IRES Dotychczas zauważono, że: VPg oddziałuje z eIF4E, interakcja niewrażliwa na analogi kapu Inhibicja kap-zależnej i IRES-zależnej translacji w RRL Translacja wirusowego RNA zależy od jego kowalencyjnego powiązania z dojrzałym VPg, niewrażliwa na analogi kapu, wymaga eIF4A oraz: FCV – hamowana przez 4E-BP, wymaga eIF4E i eIF4G zdolnego do wiązania eIF4E MNV – niewrażliwa na 4E-BP, nie potrzebuje oddziaływania z eIF4E, ani interakcji eIF4E-eIF4G Zakład Biofizyki, IFD UW 26

27 Dziękuję za uwagę! Zakład Biofizyki, IFD UW 27


Pobierz ppt "Anna Kropiwnicka dr Joanna Żuberek"

Podobne prezentacje


Reklamy Google