LOGO Identyfikacja genów zależnych od czynnika transkrypcyjnego NFκB, na których ekspresję ma wpływ czynnik transkrypcyjny HSF1 Patryk Janus.

Prezentacja na temat: "LOGO Identyfikacja genów zależnych od czynnika transkrypcyjnego NFκB, na których ekspresję ma wpływ czynnik transkrypcyjny HSF1 Patryk Janus."— Zapis prezentacji:

1 LOGO Identyfikacja genów zależnych od czynnika transkrypcyjnego NFκB, na których ekspresję ma wpływ czynnik transkrypcyjny HSF1 Patryk Janus

2 www.themegallery.com Company Logo Problem naukowy Czynniki transkrypcyjne NFκB i HSF1 są kluczowym elementem odpowiedzi na stres komórkowy

3 www.themegallery.com Company Logo Model badawczy U2-OS  Ludzkie komórki kostniako – mięsaka (osteosarkomy) a) typu „dzikiego” (wild type): brak aktywacji HSF1 i niskim poziom białek HSP70i w normalnych warunkach hodowli in vitro (37°C, 5% CO2) aktywacja HSF1 i akumulacja białek HSP70 pod wpływem szoku termicznego (hodowla w 43°C przez 1h) ekspozycja na cytokinę TNFa w sposób „standardowy” indukuje aktywację szlaku sygnałowego zależnego od NFkB b) z nadekspresją konstytutywnie aktywnego „transgenicznego” czynnika HSF1 (tgHSF1): sekwencja kodująca HSF1ΔRD (białko HSF1 z delecją domeny regulatorowej ΔRD) wprowadzona do komórek U2OS na drodze stabilnej transfekcji retrowirusowej (w wektorze pLNCX2)

4 www.themegallery.com Company Logo Przebieg eksperymentu i analiza wyników 1 2 33 44 Stymulacja komórek cytokiną TNFα (30’) Izolacja RNA 1h po zakończeniu stymulacji cytokiną TNFα Synteza cDNA Ilościowa analiza ekspresji genów regulowanych przez NFkB z użyciem zestawu mikroreakcji RT-PCR (PCR Array) 35 Dodatkowa analiza wybranych genów metodą RT-PCR

5 www.themegallery.com Company Logo PCR Array

6 www.themegallery.com Company Logo Analiza danych - optymalizacja IL-8  U2-OS WT, kontrolaIL-8  U2-OS WT, 1h po TNFa

7 www.themegallery.com Company Logo Analiza danych - optymalizacja przed przeskalowaniem po przeskalowaniu

8 www.themegallery.com Company Logo Standaryzacja IL-8  U2-OS WT, kontrola przed przeskalowaniem IL-8  U2-OS WT, kontrola po przeskalowaniu

9 www.themegallery.com Company Logo Redukcja szumu

10 www.themegallery.com Company Logo Punkty odcięcia Gens crossed with base line [500] 'IL1B' [29.3093] [29.4595] [29.6106] [30.5674] [30.8332] [30.8230] 'IL6' [37.4527] [37.3646] [37.2704] [38.3367] [38.2889] [38.2222] 'IL8' [28.0098] [27.8890] [28.0535] [28.6874] [28.6163] [28.6916] 'FOS' [31.7415] [31.6183] [31.7041] [31.8384] [32.1007] [32.2479] 'GAPDH' [21.0418] [21.2466] [21.3040] [27.0975] [27.4250] [27.5062] GensExp crossed with base line [500] 'IL1B' [29.2418] [29.2812] [29.2918] [30.2671] [30.4769] [30.4427] 'IL6' [36.3226] [36.1936] [36.1454] [36.8908] [36.8153] [37.0998] 'IL8' [19.8589] [19.8427] [19.7888] [20.2516] [20.2935] [20.3216] 'FOS' [24.6879] [25.6804] [25.7138] [25.6322] [25.9671] [25.9731] 'GAPDH' [21.2166] [21.3419] [21.3933] [26.7399] [27.0183] [27.2254]

11 www.themegallery.com Company Logo Punkty odcięcia

12 www.themegallery.com Company Logo Poziom ekspresji Poziom ekspresji (E) w odniesieniu do kontroli: E = 2 –ΔCt ΔCt = cycleExp - cycleCtr

13 www.themegallery.com Company Logo PCR-Array – wyniki: Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w danej linii komórkowej

14 www.themegallery.com Company Logo PCR-Array – wyniki: Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w linii U2-OS WT

15 www.themegallery.com Company Logo PCR-Array – wyniki: Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w danej linii komórkowej

16 www.themegallery.com Company Logo PCR-Array – wyniki: Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w linii U2-OS WT

17 www.themegallery.com Company Logo PCR-Array Vs RT-PCR: PCR ARRAY RT-PCR Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w danej linii komórkowej Poziom ekspresji w stosunku do kontroli w linii U2-OS WT

18 LOGO Dziękuję za uwagę