Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Przeciwciała, które można bezpiecznie i skutecznie stosować w terapiach ludzi Czy długotrwałą terapię można prowadzić wykorzystując przeciwciała zwierzęce?

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Przeciwciała, które można bezpiecznie i skutecznie stosować w terapiach ludzi Czy długotrwałą terapię można prowadzić wykorzystując przeciwciała zwierzęce?"— Zapis prezentacji:

1 Przeciwciała, które można bezpiecznie i skutecznie stosować w terapiach ludzi Czy długotrwałą terapię można prowadzić wykorzystując przeciwciała zwierzęce?

2 Nie można stosować przeciwciał zwierzęcych w terapiach u ludzi HAMA – human anti-mouse antibody Jakie mogą być skutki HAMA? Negatywne efekty ze strony układu odpornościowego włącznie z reakcjami alergicznymi (nawet szok anafilaktyczny). Osłabienie terapeutycznego efektu przeciwciał

3 Rozwój technik genetyki molekularnej umożliwił tworzenie przeciwciał chimerycznych i humanizowanych CDRs – complementarity determining regions Bric.postech.ac.kr/.../2001/ _1.html Mysie Humanizowane Chimeryczne Ludzkie Regiony zmienne CDR

4 Czy reakcja układu odpornościowego będzie silniejsza przeciwko humanizowanym przeciwciałom niż całkowicie ludzkim przeciwciałom? Dlaczego dąży się do uzyskiwania całkowicie ludzkich przeciwciał? Co to są przeciwciała antyidotypowe?

5 Jak można uzyskać całkowicie ludzkie przeciwciała monoklonalne?  wykorzystując myszy SCID (severe combined immunodeficiency)  wykorzystując technikę immunizacji „in vitro”  wykorzystując technikę ekspresji fagowej – ang. phage display  wykorzystując myszy transgeniczne, u których geny kodujące mysie immunoglobuliny zastąpiono genami kodującymi ludzkie immunoglobuliny

6 Próby uzyskiwania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przy wykorzystaniu myszy SCID SCID – severe combined immunodeficiency ciężki, złożony niedobór immunologiczny SCID hu-hematochimeric mice Są to myszy, u których częściowo rekonstruuje się układ odpornościowy człowieka – transplantacja tkanek płodowych: fragmentów kości, grasicy, węzłów chłonnych. W wyniku immunizacji dochodzi do aktywacji ludzkich komórek B i produkcji ludzkich przeciwciał. Stanowią dogodny model do badania chorób człowieka (nowotwory, zakażenia wirusowe np. HIV).

7 SCID nude brak B i T brak T (i sierści) SCID – mutacja w obrębie genu PRKDC (ang. protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide) biorącego udział w rekombinacji VDJ. Nude – mutacja w genie FOXN1. Brak rozwoju grasicy.

8 Uzyskiwanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych techniką immunizacji in vitro Idea: Jeśli umieścimy na szalce limfocyty ludzkie wyizolowane z krwi obwodowej i dodamy antygen, to limfocyty B specyficznie rozpoznające antygen ulegną aktywacji i zaczną produkować przeciwciała. Można je unieśmiertelnić wykorzystując wirus Epsteina-Barr (Michael Epstein i Yvonne Barr) Pierwszy problem: W takiej kokulturze komórki B bardzo szybko ulegały apoptozie. Stosowanie Leu-Leu-O-Me (ester metylowy leucylo-leucyny) prowadzi do apoptozy komórek NK i Tc, które przyczyniały się do śmierci komórek B. Drugi problem: albo nie udawało się w ogóle uzyskać komórek B produkujących przeciwciała, albo uzyskiwano komórki B produkujące IgM o niskim powinowactwie. Leu-Leu-O-Me trafia do lizosomów, gdzie jest przekształcany przez dipeptydazę peptydową I (katepsyna C) w związek membranolityczny. Różne typy komórek są w różnym stopniu wrażliwe na Leu-Leu-O-Me.

9 Cały czas próbuje się ulepszać procedurę Wprowadzono dwie immunizacje: 1.Prowadzi do powstania pierwotnej odpowiedzi (IgM) 2.Prowadzi do dojrzewania limfocytów B (IgG, wyższa specyficzność) Do immunizacji stosuje się białko fuzyjne („nasz” Ag + powszechny epitop komórek T helper np. z toksyny tężca (TT)). W tej sytuacji komórki do immunizacji muszą pochodzić od jednej osoby, która wykazuje obecność komórek pamięci pomocniczych limfocytów T specyficznych dla epitopu TT.

10 Schemat procedury immunizacji in vitro PBMC: peripheral blood mononuclear cells: T (70%), B (15%), NK (10%), monocyty (5%), komórki dendrytyczne (<1%) TRF: T-cell replacing factor (CM z T-cell, stymulowanych mitogenem) k. żywiciele – naświetlane monocyty krwi obwodowej

11 Schemat drugiej immunizacji in vitro Po pierwszej immunizacji – tylko IgM Po drugiej immunizacji – przewaga IgM, ale pojawiają się IgG

12 Są to myszy transgeniczne: z wyłączonymi genami kodującymi mysie immunoglobuliny z wstawionymi funkcjonalnymi genami kodującymi ludzkie immunoglobuliny Uzyskiwanie ludzkich monoklonalnych przeciwciał z wykorzystaniem specjalnych myszy transgenicznych Abgenix – biotechnologiczno- farmaceutyczna firma z Kalifornii Wyprowadzono szereg szczepów myszy (XenoMouse) produkujących ludzkie przeciwciała: IgG1 , IgG2  IgG4  IgG1  IgG2  IgG4 Dwie inne firmy: w USA – Medarex (HuMab) i w Danii – Genmab (używa myszy HuMab)

13 IgH – obszar kodujący części zmienne i jedną z części stałych łańcucha ciężkiego ( ,  i jeden z  ). 1/16 F2 1/16 F2

14 YAC – sztuczny chromosom drożdżowy; zawiera 34 V H, wszystkie 23 D H i wszystkie 6 J H oraz C , C  i jeden z C  Dlaczego wyprowadzono szczepy myszy z różnymi izotypami?

15 IgG1 oraz IgG3 wiążą się z dużym powinowactwem do FcR makrofagów i komórek NK IgG1 oraz IgG3 aktywują dopełniacz IgG2 i IgG4 wiążą się z FcR z niskim powinowactwem. Nie aktywują dopełniacza. Jeśli chcemy aby nasze mAb rozpoznawały antygen na powierzchni komórek nowotworowych i prowadziły do ich eliminacji to wybierzemy myszy, które wykazują ekspresję......? Jeśli chcemy, aby nasze mAb np. blokowały jakiś receptor, ale nie były cytotoksyczne to wybierzemy myszy, które wykazują ekspresję......?

16 XenoMouse 1.Immunizacja myszy prowadzi do stymulacji wzrostu komórek B produkujących specyficzne ludzkie przeciwciała. 2.W celu uzyskania przeciwciał monoklonalnych można zastosować klasyczną fuzję z komórkami mysiego szpiczaka. Komórki hybrydoma będą produkowały ludzkie przeciwciała. 3.Firma Abgenix opracowała także technikę – XenoMax (tajemnica firmy). Prawdopodobnie udoskonalono procedurę hodowli komórek B i unieśmiertelniania mysich komórek B (np. stosując wirus Epsteina-Barr).

17 ABX-EGF (panitumumab) blokuje receptor dla EGF (HER1) wykazujący nadekspresję w wielu typach nowotworów, np. płuc, piersi, nerki, pęcherza, jelita grubego. Pierwsze przeciwciało uzyskane metodą XenoMouse dopuszczone powszechnie do terapii przez Food and Drug Administration (FDA). Obecnie na rynku są już kolejne – Ustenkinumab (anty p40 IL12/IL23) i Denosumab (anty-RANKL). ABX-MA1 wiąże się z białkiem MUC18. Jest to białko adhezyjne wykazujące nadekspresję w komórkach czerniaka (melanoma), niektóyrch mięsakach, raku prostaty i układu moczowego. ABX-PTH wiąże i inaktywuje hormon przytarczyc (PTH). Ma znaleźć zastosowanie w terapii nadczynności przytarczyc, często związanej z chorobami nerek. Nadmiar PTH prowadzi do dekalcyfikacji kości.

18 Przeciwciała firmy Genmab: NazwaCel terapii HuMax-CD4 Zanolimumab chłoniaki HuMax-EGFRNowotwory pochodzenia epitelialnego HuMax-HepCWirus Hepatitis C HuMax-Inflam Anty-IL8 Różne choroby o podłożu zapalnym HuMax-TACOdrzucanie przeszczepów AMG-714 (HuMax-IL15) Reumatoidalne zapalenie stawów Wszystkie są w różnych fazach prób klinicznych. NazwaCel terapii Canakinumab Anty-IL1 Choroby autoimmunologiczne Golimumab Anty-TNF Chroniczne choroby o podłożu zapalnym Przeciwciała firmy Medarex:

19 Nazewnictwo przeciwciał terapeutycznych IL2R  DaclizumabZenapax gpIIb/IIIaAbciximabReoPro HER2TrastuzumabHerceptin wirus RSVPalivizumabSynagis TNFAdalimumabHumira TNFInfliximabRemicade IL2R  BasiliximabSimulect CD20RituximabRituxan CD3MuronomabOKT3 Cel Nazwa producenta Nazwa handlowa VEGFBevacizumabAvastin IgEOmalizumabXolair EGFR (HER1) CetuximabErbitux

20 Nazewnictwo przeciwciał terapeutycznych omab mysie ximab chimeryczne zumab humanizowane umab ludzkie -ci -tu -lim lub - li -vi

21 Uzyskiwanie fragmentów przeciwciał metodą ekspresji fagowej (phage display)

22 IDEA: Skonstruować bibliotekę zawierającą możliwie jak najwięcej (1 x 10 11, przeciętne biblioteki mają > 1 x 10 8 ) cDNA kodujących przeciwciała. Mieć możliwość prostego i szybkiego wyszukania takich cDNA, które kodują białko rozpoznające nasz antygen. najwygodniej: opracować taką metodę, aby znajdując białko, które oddziałuje z naszym antygenem mieć „w garści” cDNA, który je koduje. Takie powiązanie genotypu z fenotypem jest możliwe dzięki ekspresji fagowej (ang. phage display)

23 Budowa faga filamentowego – M13

24 gen białko (kDa) funkcja II X V VIII III VI VII IX I IV XI 46,1 12,7 9,7 5,2 45,5 12,3 3,6 3,7 39,5 43,5 12,4 replikacja DNA wiązanie ssDNA główne białko kapsydu białko kapsydu składanie faga DNA faga koduje 11 białek

25 Cykl życiowy faga filamentowego Fag zakaża jedynie bakterie F+ poprzez oddziaływanie białka pIII z pilusem i białkami wewnętrznej błony bakterii – TolQ, R, A DNA wirusowe („+”) wnika do komórki bakteryjnej Nić komplementarna jest dobudowywana przez enzymy bakteryjne – tworzy się struktura dwuniciowa – RF DNA (replicative form). Nić komplementarna jest matrycą dla transkrypcji. Składanie faga – istotna sekwencja PS – packaging signal; Białko pVIII otacza DNA – im dłuższe DNA tym więcej cząsteczek białka pVIII. Fagi filamentowe nie zabijają swoich gospodarzy, spowalniają jedynie ich wzrost

26 Ekspresja z wykorzystaniem pVIII fag typu 8 fag typu 88 fag typu 3 fag typu 33 Ekspresja z wykorzystaniem pIII

27 Fagi 8 oraz 88 można wykorzystywać do ekspresji krótkich peptydów Fagi 3 oraz 33 – wykorzystuje się do ekspresji małych białek, ale często dochodzi do znacznego osłabienia infekcyjności faga

28 SYSTEM FAGEMIDOWY genom faga pomocniczego

29 System fagemidowy Składa się z: Wektora fagemidowego (np. pComb3H) Faga pomocniczego (zmodyfikowany fag filamentowy) Wektor fagemidowy to plazmid zawierający: plazmidowe ori (namnażanie dsDNA) fagowe ori (namnażanie ssDNA) sygnał pakowania marker oporności (inny niż zawarty w fagu pomocniczym) kasetę kodującą białko fuzyjne – fragment przeciwciała/pIII (biblioteka) Fag pomocniczy: fag filamentowy, którego genom charakteryzuje się: mutacją w ori (osłabienie replikacji) mutacją w sygnale pakowania (osłabione wykorzystanie DNA faga pomocniczego do składania faga) marker oporności (inny niż zawarty w fagemidzie)

30 Fag pomocniczy dostarcza wszystkich białek potrzebnych do namnażania fagemidu, pakowania fagemidu i białek otoczki fagemidu. W komórkach bakteryjnych zakażonych fagiem i stransformowanych fagemidem przede wszystkim do kapsydu pakowane jest DNA fagemidowe, gdyż DNA fagów słabo replikuje (osłabione ori) i w małym stopniu ulega pakowaniu (osłabiony sygnał pakowania).

31 Formaty bibliotek przeciwciał Fab 20 aa łącznik 7 aa łącznik sprzyja tworzeniu monomerów dimerów scFv = single chain variable fragments (pojedynczy łańcuch fragmentów zmiennych) scFv

32

33 Kaseta ekspresyjna fagemidu pComb3H Ekspresja Fab Sfi I – rozpoznaje rzadką sekwencję: GGCCNNNN  NGGCC (RBS)

34 SD – sekwencja Shine-Dalgarno = RBS PS – peptyd sygnałowy pIII

35 Kaseta ekspresyjna fagemidu pComb3H Ekspresja scFv

36 Typy bibliotek fagowych (fagemidowych) swoiste (immune) nieswoiste (naive) naturalne półsyntetyczne/syntetyczne

37 CDR1CDR3CDR2 V D J

38 Przygotowanie konstruktów genowych metodą PCR

39 Amplifikacja fragmentów łańcuchów lekkich - miejsce restrykcyjne SfiI (wydłużanie komplementarnych końców)

40 Amplifikacja fragmentów łańcuchów ciężkich PCR I CH1

41 PCR III

42 Do amplifikacji fragmentów zmiennych wykorzystuje się cDNA uzyskane przez odwrotną transkrypcję RNA wyizolowanego z limfocytów krwi obwodowej albo ze szpiku kostnego. To RNA zawiera bardzo dużo rozmaitych sekwencji immunoglobulin Powiela się więc bardzo dużo rozmaitych sekwencji wykorzystując fakt, że sekwencje zrębowe Ig są podobne

43 Biblioteka naturalna (scFv)

44 Biblioteka semisyntetyczna

45 Biblioteka syntetyczna

46 1.Przygotowanie elektrokompetentnych bakterii – E. coli - F+ 2.Przygotowanie faga pomocniczego (namnożenie, oszacowanie ilości) 3.Trawienie restryktazą Sfi I – zarówno DNA fagemidu pComb3H oraz produktów PCR 4.Ligacja pComb3H z produktami PCR III 5.Wprowadzenie fagemidów do bakterii – elektroporacja 6.Zakażenie hodowli fagiem pomocniczym 7.Hodowla bakterii w obecności antybiotyków (markery oporności faga i fagemidu) 8.Izolacja fagów z supernatantu po hodowli bakterii (strącanie przy pomocy glikolu polietylenowego) 9.MAMY GOTOWĄ BIBLIOTEKĘ FAGOWĄ Przygotowanie biblioteki fagemidowej

47 Gorączka Złota – USA, Kanada XIX w. PANNING

48 Selekcja fagów - panning Procedurę powtarza się wielokrotnie (3-6 razy), za każdym razem zwiększając ilość płukań: 5, 10, 15 razy.

49 Monitorowanie selekcji fagów

50 izolacja pojedynczych klonów, amplifikacja, analiza synteza w E.coli z wykorzystaniem pComb3H, który zawiera sekwencje pozwalające na wykrywanie i oczyszczanie białka (fragment hemaglutyniny, His-tag) i który nie zawiera fragmentu białka pIII (uzyskuje się rozpuszczalne scFv). analiza sekwencji DNA ewentualnie: wklonowanie do eukariotycznego wektora ekspresyjnego – ekspresja w komórkach eukariotycznych dalsze modyfikacje z wykorzystaniem inżnierii genetycznej (mutacje punktowe, budowanie „całych” przeciwciał, dodawanie sekwencji liderowych itp). Dalsze etapy uzyskiwania fragmentów przeciwciał

51 wektor fagemidowy pIT2 M13 ori colE1 ori amp promotor lacZ scFv myc pIII RBS UAG Wektor pIT2 pozwala na produkcję fagów prezentujących scFv oraz na produkcję rozpuszczalnych przeciwciał w zależności od szczepu bakterii Szczep E. coli TG1 nie rozpoznaje UAG jako stop.

52 Dojrzewanie przeciwciał można zastąpić przez „error-prone” PCR Po takim PCR uzyskuje się nową bibliotekę fagemidową, która będzie zawierała sekwencje kodujące scFv zarówno lepiej jak i gorzej dopasowane do Ag Powtarzamy selekcje


Pobierz ppt "Przeciwciała, które można bezpiecznie i skutecznie stosować w terapiach ludzi Czy długotrwałą terapię można prowadzić wykorzystując przeciwciała zwierzęce?"

Podobne prezentacje


Reklamy Google