Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników Reaktywne formy tlenu O2●–O2●– H2O2H2O2 ONOO – NO ● OH ● Inhibicja proliferacji Osłabiona odpowiedź immunologiczna.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników Reaktywne formy tlenu O2●–O2●– H2O2H2O2 ONOO – NO ● OH ● Inhibicja proliferacji Osłabiona odpowiedź immunologiczna."— Zapis prezentacji:

1 Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników Reaktywne formy tlenu O2●–O2●– H2O2H2O2 ONOO – NO ● OH ● Inhibicja proliferacji Osłabiona odpowiedź immunologiczna Generacja uszkodzeń Aktywacja szlaków sygnałowych Homeosta za E N D O G E N N E mitochondria peroksysomy oksydaza NADPH E G Z O G E N N E UVpromien. jonizujące proc. zapalne chemioterapia toksyny

2  aktywacja ERK1/2  aktywacja AP-1  translokacja NFκB  aktywacja PKC-α ROLA FIZJOLOGICZNA Reaktywne Formy Tlenu USZKODZENIA I CHOROBY  odpowiedź zapalna  relaksacja mięśni gładkich  mitogeneza  apoptoza  peroksydacja lipidów  utlenianie cukrów i tioli  oksydacja DNA  uszkodzenia kwasów nukleinowych  starzenie  karcenogeneza  miażdżyca  choroby neurodegeneracyjne

3 Obrona antyoksydacyjna ENZYMATYCZNA albumina NIEENZYMATYCZNA dysmutazy ponadtlenkowe (SOD) katalaza (CAT) peroksydaza glutationu (GPX) glutation metalotioneiny melatoniny flawonoidy witaminy ACE

4 dysmutaza ponadtlenkowa lokalizacja komórkowa CuZnSOD (SOD1)Cytoplazma MnSOD (SOD2)Mitochondria, błona wewn. ECSOD (SOD3)błona komórkowa, zewn. 0.1% - 2% pobieranego tlenu ulega konwersji do anionorodnika ponadtlenkowego (O 2 ●– ) O2●–O2●– H2O2H2O2 SOD H 2 O + O 2 CAT GPX

5 Manganozależna Dysmutaza Ponadtlenkowa (MnSOD, SOD2)  homotetramer – 88 kDa  zawiera jony Mn w miejscu aktywnym  zlokalizowana w błonie wewnętrznej mitochondrium  kodowana przez gen jądrowy  gen MnSOD jest złożony z 5 eksonów i 4 intronów E1 E2 E3 E4 E5

6 MnSOD jest niezbędny zwierzęta KNOCK-OUT Li et al., 1995:  spowolniony wzrost  niewydolność fizyczna  kardiomiopatia rozstrzeniowa  powiększona wątroba  depozyty bałkowe w mięśniach szkieletu Lebovitz et al., 1996:  spowolniony wzrost  niewydolność fizyczna  zaburzenia motoryczne  zmiany degeneracyjne w o.u.n.  uszkodzone i napęczniałe mitochondria wszystkie zwierzęta pozbawione genu MnSOD umierają przed 2 tyg. życia

7 GPX intron Myc tag MnSOD cDNAIRESEGFP Konstrukt DNA użyty do wygenerowania nadekspresji MnSOD pTRE2hyg/SOD2ex plazmid ekspresyjny

8 Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy P CMV tetR VP16 tTA MnSODEGFP TREP CMV MnSODEGFP TREP CMV tTA +Dox (Tet) –Dox (Tet) XX plazmid regulacyjny plazmid ekspresyjny Tet-OFF

9 Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy P CMV tetR VP16 tTA MnSODEGFP TREP CMV MnSODEGFP TREP CMV tTA +Dox (Tet) –Dox (Tet) XX plazmid regulacyjny plazmid ekspresyjny Tet-ON

10 Tet-OFF + plazmid ekspresyjny Tet-ON + plazmid ekspresyjny ─ Dox + Dox Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy

11 Regulowana nadekspresja MnSOD – system Tet-OFF expression ON nadekspresja expression OFF ekspresja fizjologiczna

12 Western blotting z użyciem przeciwciała Anti-MnSOD Żel aktywności MnSOD 1 – komórki nietransfekowane 2 – transfekowane - Dox 3 – transfekowane + Dox 1 – nadekspresja 2 – kontrolna transfekc. 3 – bez transfekc. Regulowana nadekspresja MnSOD – potwierdzenie działania funkcjonalnego

13 ĆWICZENIE pSuper-SOD2- RNAi

14 DNA użyty do transfekcji: Tet-OFF + SODex + pSuper Transfekcje komórek Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi

15 Tet-OFF + SODex + pSuper Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi 1 2 ANALIZA FACS

16 Tet-OFF + SODex + pSuper Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi 3 4 ANALIZA FACS

17 Wprowadzić dyskusję nt. jak wykonać eksperyment naukowy do sprawdzenia wyciszania, aktywności Tg na poziomach mRNA i białkowym. Jak zaplanować eksperyment – jakie są potrzebne kontrole ?


Pobierz ppt "Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników Reaktywne formy tlenu O2●–O2●– H2O2H2O2 ONOO – NO ● OH ● Inhibicja proliferacji Osłabiona odpowiedź immunologiczna."

Podobne prezentacje


Reklamy Google