Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

METODY HISTOCHEMICZNE - przygotowanie, metody barwienia, określenie wewnątrzkomórkowych enzymów w tkance mgr Małgorzata Semik Politechnika Rzeszowska.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "METODY HISTOCHEMICZNE - przygotowanie, metody barwienia, określenie wewnątrzkomórkowych enzymów w tkance mgr Małgorzata Semik Politechnika Rzeszowska."— Zapis prezentacji:

1 METODY HISTOCHEMICZNE - przygotowanie, metody barwienia, określenie wewnątrzkomórkowych enzymów w tkance mgr Małgorzata Semik Politechnika Rzeszowska

2 HISTOCHEMIA Cytochemia – dział biochemii zajmujący się badaniem komórek. Bada skład chemiczny oraz procesy chemiczne zachodzące w poszczególnych organellach komórkowych oraz w komórce. Histochemia – nauka z pogranicza histologii i biochemii. Bada skład chemiczny i procesy biochemiczne w obrębie tkanek, stosując metody nie uszkadzające struktury badanego obiektu. Celem histochemii jest identyfikacja i lokalizacja poszczególnych substancji chemicznych w tkankach i komórkach, umożliwia śledzenie badanych reakcji dokładnie w miejscu ich powstawania. umożliwia śledzenie badanych reakcji dokładnie w miejscu ich powstawania.

3 HISTOCHEMIA Dzięki metodom histochemicznym można precyzyjnie oznaczać w tkankach: białka, białka, kwasy nukleinowe, kwasy nukleinowe, enzymy, enzymy, węglowodany węglowodany Immunohistochemia – jest to metoda wykrywania rozmaitych substancji antygenowych w skrawkach mikroskopowych przy zastosowaniu przeciwciał skierowanych przeciwko poszukiwanym składnikom preparatu. Histologia – nauka badająca czynności, rozwój i budowę tkanek.

4 PODSTAWY REAKCJI HISTOCHEMICZNYCH Reakcje histochemiczne cechuje specyficzność – swoistość. Reakcje histochemiczne cechuje specyficzność – swoistość. Oddziaływanie pomiędzy wykrywaną substancją (obecną w materiale biologicznym a związkami chemicznymi (wprowadzonymi do środowiska reakcji chemicznej). Oddziaływanie pomiędzy wykrywaną substancją (obecną w materiale biologicznym a związkami chemicznymi (wprowadzonymi do środowiska reakcji chemicznej). Prowadzi to do powstania produktu reakcji chemicznej (w miejscu występowania wykrywanej substancji). Ilość powstającego produktu jak i jego lokalizacja wykrywane są w obrazie mikroskopowym. wykrywana substancja odpowiedni związek chemiczny PRODUKT REAKCJI CHEMICZNEJ

5 PODSTAWY REAKCJI HISTOCHEMICZNYCH Produkt reakcji chemicznej musi spełniać dwa podstawowe warunki: Musi być widoczny w obrazie mikroskopowym Musi być widoczny w obrazie mikroskopowym Powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji Powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji Końcowa ocena reakcji histochemicznych odbywa się przy użyciu wszystkich typów mikroskopów świetlnych i elektronowych.

6 TYPY REAKCJI HISTOCHEMICZNYCH Reakcja bezpośrednia – wykrywana substancja reaguje z odpowiednim substratem, prowadzi to do powstania barwnego produktu w miejscu lokalizacji danej substancji, np. uwidacznia reszty tyrozynowe białek Reakcja bezpośrednia – wykrywana substancja reaguje z odpowiednim substratem, prowadzi to do powstania barwnego produktu w miejscu lokalizacji danej substancji, np. uwidacznia reszty tyrozynowe białek Reakcja specyficznego wiązania niektórych barwników przez określone związki wysokocząsteczkowe, np. wykrywanie DNA zielenią metylową Reakcja specyficznego wiązania niektórych barwników przez określone związki wysokocząsteczkowe, np. wykrywanie DNA zielenią metylową Selektywna rozpuszczalność niektórych barwników – identyfikacja lipidów Sudanem III Selektywna rozpuszczalność niektórych barwników – identyfikacja lipidów Sudanem III Reakcja specyficzna wykrywania enzymów – produktów reakcji tych enzymów Reakcja specyficzna wykrywania enzymów – produktów reakcji tych enzymów Reakcja dwu- lub kilkuetapowa – wykrywanie wielocukrów, w podwójnej reakcji Reakcja dwu- lub kilkuetapowa – wykrywanie wielocukrów, w podwójnej reakcji reakcja utleniania wielocukrów, zmiana struktury wykrywanej substancji reakcja utleniania wielocukrów, zmiana struktury wykrywanej substancji reakcja barwna, identyfikację interesującego nas związku chemicznego reakcja barwna, identyfikację interesującego nas związku chemicznego

7 PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU Wybór metodyki przygotowywania materiału biologicznego do reakcji histochemicznej zależy od: charakteru badanej substancji charakteru badanej substancji specyficzności reakcji zastosowanej do identyfikacji tej substancji specyficzności reakcji zastosowanej do identyfikacji tej substancji Trzy podstawowe warunki: 1. Preparat przygotowany z materiału musi być przejrzysty, 2. Odpowiednio skontrastowany (wybarwiony) 3. Struktura komórek i tkanek w preparacie powinna być jak najbardziej zbliżona do struktury tkanki żywej Główny cel to: jak najlepsze uwidocznienie interesującej nas substancji, co jest warunkiem prawidłowej identyfikacji

8 PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU Metody przygotowywania materiału do badań histochemicznych opierają się na kilku działaniach laboratoryjnych: 1. POBIERANIE MATERIAŁU, 2. UTRWALANIE MATERIAŁU, 3. UTWARDZENIE I KROJENIE MATERIAŁU – (ZATAPIANIE, MROŻENIE) 4. WYKONANIE PREPARATU I JEGO BARWIENIE

9 POBIERANIE MATERIAŁU Materiał tkankowy – fragmenty tkanek lub narządów (rozmazy, szlify, skrawki), hodowle komórkowe. Przy pobieraniu materiału ważne jest: fragment pobranej tkanki powinien być stosunkowo niewielki fragment pobranej tkanki powinien być stosunkowo niewielki 5mm – mikroskopia świetlna, 5mm – mikroskopia świetlna, 1mm – mikroskopia elektronowa, 1mm – mikroskopia elektronowa, tkanki do badań histochemicznych enzymów powinny być przetwarzane jak najszybciej po zakończeniu pobierania, tkanki do badań histochemicznych enzymów powinny być przetwarzane jak najszybciej po zakończeniu pobierania, natychmiast po pobraniu fragment narządu, tkanki należy utrwalić natychmiast po pobraniu fragment narządu, tkanki należy utrwalić

10 UTRWALANIE MATERIAŁU UTRWALANIE – procedura zachowania materiału w jego pierwotnej postaci. Cel utrwalania to: zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, precypitacja niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych, precypitacja niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych, wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności, wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności, Rodzaj utrwalacza i czas utrwalania: wybór utrwalacza powinien być uzależniony od rodzaju identyfikowanego związku chemicznego, tak aby nie uległ on zmianie pod jego wpływem wybór utrwalacza powinien być uzależniony od rodzaju identyfikowanego związku chemicznego, tak aby nie uległ on zmianie pod jego wpływem czas utrwalania zależy od rodzaju zastosowanego utrwalacza, rodzaju tkanki oraz wielkości wycinka, zwykle jest nie krótszy niż 12 godzin. czas utrwalania zależy od rodzaju zastosowanego utrwalacza, rodzaju tkanki oraz wielkości wycinka, zwykle jest nie krótszy niż 12 godzin.

11 ZATAPIANIE MATERIAŁU ZATAPIANIE MATERIAŁU – polega na przepojeniu materiału w twardszym, lecz łatwo skrawalnym i biochemicznie obojętnym materiale. PARAFINA najpowszechniej stosowana w badaniach histochemicznych, do wykrywania: PARAFINA najpowszechniej stosowana w badaniach histochemicznych, do wykrywania: Białek Białek Kwasów nukleinowych Kwasów nukleinowych Węglowodanów Węglowodanów CELOIDYNA (dwunitroceluloza), do zatapiania materiałów twardych CELOIDYNA (dwunitroceluloza), do zatapiania materiałów twardych ŻYWICE (epoksydowe, akrylowe) ŻYWICE (epoksydowe, akrylowe)

12 ZAMROŻENIE MATERIAŁU TECHNIKA MROŻENIOWA – polega na utwardzeniu preparatu poprzez jego zamrożenie. Zamrażanie – metody: ZAMRAŻANIE W CIEKŁYCH GAZACH ZAMRAŻANIE W CIEKŁYCH GAZACH ZAMRAŻANIE PRZY POMOCY ZESTALONEGO CO2 ZAMRAŻANIE PRZY POMOCY ZESTALONEGO CO2 ZAMRAŻANIE W KRIOSTACIE ZAMRAŻANIE W KRIOSTACIE Szeroko stosowana w histochemii i immunohistochemii. Zalety: Krótkotrwała, Krótkotrwała, Zachowuje w materiale biologicznym wszystkie składniki chemiczne (także lipidy), Zachowuje w materiale biologicznym wszystkie składniki chemiczne (także lipidy), Przebiega w niskiej temperaturze (zapobiega denaturacji białek oraz inaktywacji enzymów) Przebiega w niskiej temperaturze (zapobiega denaturacji białek oraz inaktywacji enzymów)

13 KROJENIE MATERIAŁU Do krojenia skrawków histologicznych służą przyrządy zwane MIKROTOMAMI. Materiał zostaje pokrojony na „plasterki” grubości ok µm. Typy mikrotomów: Mikrotom rotacyjny (wibracyjny), umożliwia Mikrotom rotacyjny (wibracyjny), umożliwia pokrojenie miękkich, niezatopionych tkanek Mikrotom wahadłowy Mikrotom wahadłowy Mikrotom saneczkowy Mikrotom saneczkowy Nowoczesne mikrotomy często wyposażone są w napęd elektryczny oraz układy elektroniczne umożliwiające regulację szybkości skrawania

14 BARWIENIE BARWIENIE MATERIAŁU - ma na celu skontrastowanie struktur komórkowych i tkankowych za pomocą zróżnicowanych barwników. BARWNIKI – posiadają dwie istotne dla ich funkcji grupy chemiczne: Chwytną (odpowiedzialną za wiązanie się cząsteczek barwnika z odpowiednimi substancjami) Chwytną (odpowiedzialną za wiązanie się cząsteczek barwnika z odpowiednimi substancjami) Barwną (decydującą o kolorze) Barwną (decydującą o kolorze) Barwienie ma niski stopień swoistości, wiele struktur i substancji w komórkach i tkankach może wiązać ten sam barwnik. Zazwyczaj używa się wodnych roztworów barwników. ZAMYKANIE PREPARATU – naniesienie na powierzchnię skrawka kropili medium zamykającego, końcowe utrwalenie preparatu (najczęściej żywica, która ulega polimeryzacji): żywice syntetyczne, balsam kanadyjski żywice syntetyczne, balsam kanadyjski

15 PODSTAWY REAKCJI HISTOCHEMICZNYCH Z reguły reakcje histochemiczną przeprowadza się po utrwalenie materiału biologicznego, a przed jego zatopieniem. W tkankach lub komórkach w celu identyfikacji różnego rodzaju substancji, przeprowadza się następujące reakcje histochemiczne: Reakcje identyfikacji węglowodanów, Reakcje identyfikacji węglowodanów, Reakcje identyfikacji lipidów, Reakcje identyfikacji lipidów, Reakcje identyfikacji aminokwasów i białek Reakcje identyfikacji aminokwasów i białek Reakcje identyfikacji enzymów (fosfataz, esteraz, dehydrogenaz, peptydaz) Reakcje identyfikacji enzymów (fosfataz, esteraz, dehydrogenaz, peptydaz) Reakcje identyfikacji kwasów nukleinowych, Reakcje identyfikacji kwasów nukleinowych, Reakcje identyfikacji wielu innych substancji (aldehydy, ketony, metaloproteiny, jony – Fe, Cd,) Reakcje identyfikacji wielu innych substancji (aldehydy, ketony, metaloproteiny, jony – Fe, Cd,)

16 IDENTYFIKACJA POLISACHARYDÓW W identyfikacji polisacharydów stosuje się następujące reakcje: Identyfikacja kwaśnych glikozaminoglikanów błękitem alcjanowym Identyfikacja kwaśnych glikozaminoglikanów błękitem alcjanowym Reakcja PAS Reakcja PAS Identyfikacja kwaśnych glikozaminoglikanów żelazem koloidalnym Identyfikacja kwaśnych glikozaminoglikanów żelazem koloidalnym Metachromazja Metachromazja

17 IDENTYFIKACJA POLISACHARYDÓW BŁĘKIT ALCJANOWY, błękit alcjański (ang. alcian blue (AB). BŁĘKIT ALCJANOWY, błękit alcjański (ang. alcian blue (AB). Barwnik kationowy, barwi kwaśne mukopolisacharydy i glikozaminoglikany Barwnik kationowy, barwi kwaśne mukopolisacharydy i glikozaminoglikany na kolor błękitny, Swoistość zabarwienia jest zależna od pH barwnika Swoistość zabarwienia jest zależna od pH barwnika Kwas hialuronowy (ze względu na swoją niewielką kwasowość) barwi się przy pH 2,5 Kwas hialuronowy (ze względu na swoją niewielką kwasowość) barwi się przy pH 2,5 wybarwiony kwaśny mukopolisacharyd

18 IDENTYFIKACJA POLISACHARYDÓW – reakcja PAS Reakcja PAS ( ang. Periodic acid-Schiff ) Reakcja PAS ( ang. Periodic acid-Schiff ) Najczęściej stosowana reakcja histochemiczna. Najczęściej stosowana reakcja histochemiczna. Reakcja dwuetapowa Reakcja dwuetapowa I etap – materiał poddaje się utlenianiu w 1% kwasie nadjodowym, powoduje to przekształcenia grup glikolowych w grupy aldehydowe I etap – materiał poddaje się utlenianiu w 1% kwasie nadjodowym, powoduje to przekształcenia grup glikolowych w grupy aldehydowe II etap – grupy aldehydowe uwidacznia się przy użyciu odczynnika Schiffa (odbarwiona forma fuksyny zasadowej) II etap – grupy aldehydowe uwidacznia się przy użyciu odczynnika Schiffa (odbarwiona forma fuksyny zasadowej) Wynik reakcji – purpurowy barwny produkt Wynik reakcji – purpurowy barwny produkt

19 REAKCJA PAS Dodatnią reakcję PAS dają: Wszystkie nierozpuszczalne polisacharydy – glikogen, skrobia, Wszystkie nierozpuszczalne polisacharydy – glikogen, skrobia, Związki takie jak: mukopolisacharydy, glikoproteiny, glikoproteidy, Związki takie jak: mukopolisacharydy, glikoproteiny, glikoproteidy, Wszystkie struktury komórkowe i tkankowe wykazujące obecność większych ilości nierozpuszczalnych polisacharydów (błony podstawne, wewnątrzkomórkowe złogi glikogenu, glikoproteidowe i śluzowe ziarna wydzielnicze), Wszystkie struktury komórkowe i tkankowe wykazujące obecność większych ilości nierozpuszczalnych polisacharydów (błony podstawne, wewnątrzkomórkowe złogi glikogenu, glikoproteidowe i śluzowe ziarna wydzielnicze), Niektóre lipidy – sfingomielina (utlenianie kwasem powoduje powstanie grup aldehydowych), Niektóre lipidy – sfingomielina (utlenianie kwasem powoduje powstanie grup aldehydowych),

20 REAKCJA PAS Reakcja PAS bardzo często używana jest do identyfikowania erytroleukemii, Erytroleukemia - rzadko występująca choroba nowotworowa niedojrzałych czerwonych krwinek Wynik barwienia – glikogen (obojętny polisacharyd), barwi się na kolor czerwono-fioletowy

21 REAKCJA PAS Obraz histologiczny komórek przerzutu mięsaka Ewinga Wymaz – wybarwione na purpurowo ziarna glikogenu

22 IDENTYFIKACJA BIAŁEK Większość histochemicznych metod wykrywania białek opiera się na reakcjach barwnych z resztami określonych aminokwasów. Reakcja Miltona z kwasem azotowym, azotanem rtęci i azotanem sodu (wykrywa reszty tyrozyny). Reakcja Miltona z kwasem azotowym, azotanem rtęci i azotanem sodu (wykrywa reszty tyrozyny). Reakcja z dwunitrofluorobenzenem (wykrywa reszty tyrozyny, -SN, -NH2), Reakcja z dwunitrofluorobenzenem (wykrywa reszty tyrozyny, -SN, -NH2), Rekacja z naftolo-etylenodwuaminą (wykrywa reszty tryptofanu), Rekacja z naftolo-etylenodwuaminą (wykrywa reszty tryptofanu), Reakcja z dwuchloronaftolem (wykrywa reszty argininy), Reakcja z dwuchloronaftolem (wykrywa reszty argininy), Reakcja z błękitem rtęciowo- bromofenolowym (wykrywa większość białek) Reakcja z błękitem rtęciowo- bromofenolowym (wykrywa większość białek) Te klasyczne metody histochemiczne służące do wykrywania białek są obecnie rzadko wykorzystywane z uwagi na możliwość stosowania bardziej swoistych metod immunohistochemicznych.

23 IDENTYFIKACJA BIAŁEK Wynik barwienia: amyloid – wszystkie typy amyloidu barwią się na kolor czerwony amyloidoza serca amyloidoza nerek Amyloid - kwasochłonne, nierozpuszczalne, nieaktywne biologicznie białko, którego nieprawidłowe pozakomórkowe odkładanie się w narządach (nerkach, wątrobie, mózgu) prowadzi do amyloidozy (skrobiawicy). Rodzaj barwnika: czerwień Kongo

24 IDENTYFIKACJA LIPIDÓW Do histochemicznego wykrywania lipidów używa się głównie barwników wykazujących niską rozpuszczalność w wodzie i alkoholu, natomiast wysoką w tłuszczach (barwnik rozpuszcza się w tłuszczu powodując jego zabarwienie): Sudan III, Sudan IV, Sudan III, Sudan IV, Barwią kwasy tłuszczowe, trójglicerydy Barwią kwasy tłuszczowe, trójglicerydy Wynik – czerwone zabarwienie Wynik – czerwone zabarwienie czerń sudanowa czerń sudanowa barwią kwasy tłuszczowe, trójglicerydy barwią kwasy tłuszczowe, trójglicerydy Wynik barwienia – czarne zabarwienie Wynik barwienia – czarne zabarwienie czerwień oleista czerwień oleista Zanurzenie skrawka tkanki zawierających skupiska lipidów do wodnego roztworu jednego z tych barwników, powoduje (zgodne ze stopniem rozpuszczalności) przejście barwnika z fazy rozpuszczalnika do fazy lipidowej.

25 IDENTYFIKACJA LIPIDÓW Inne ściśle histochemiczne metody barwienia lipidów, odznaczają się wyższą swoistością i używane są do różnicowania poszczególnych klas lipidów. Należą tu: Reakcja z kwasem fosforomolibdenowym (wykrywa lipidy bogate w holinę) Reakcja z kwasem fosforomolibdenowym (wykrywa lipidy bogate w holinę) Reakcja z dwufenylokarbozonem i rtęcią (wykrywa lecytyny i sfingomieliny) Reakcja z dwufenylokarbozonem i rtęcią (wykrywa lecytyny i sfingomieliny) Reakcja bromkowo – srebrowa (wykrywa lipidy nienasycone) Reakcja bromkowo – srebrowa (wykrywa lipidy nienasycone) Reakcja z ftalocyjanianem miedzi (wykrywa fosfolipidy) Reakcja z ftalocyjanianem miedzi (wykrywa fosfolipidy) Lipidy wybarwione czerwienią oleistą

26 IDENTYFIKACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH Do reakcji służących do wykrywania kwasów DNA i RNA należy: Reakcja Feulgena – służy do wykrywania DNA. Składa się z dwóch etapów Składa się z dwóch etapów I etap – tkankę poddaje się hydrolizie w 1N kwasie solnym, powoduje to pękniecie pierścienia pentozowego dezoksyrybozy i wytworzenie grupy aldehydowej I etap – tkankę poddaje się hydrolizie w 1N kwasie solnym, powoduje to pękniecie pierścienia pentozowego dezoksyrybozy i wytworzenie grupy aldehydowej II etap – wykrywanie wolnej grupy aldehydowej odczynnikiem Schiffa II etap – wykrywanie wolnej grupy aldehydowej odczynnikiem Schiffa DNA barwi się na zczerwono DNA barwi się na zczerwono Nie służy do wykrywania RNA (hydroliza nie powoduje pęknięcia pierścieni rybozy) Nie służy do wykrywania RNA (hydroliza nie powoduje pęknięcia pierścieni rybozy)

27 IDENTYFIKACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH Reakcja Bracheta – służy do różnicowego wykrywania DNA i RNA w tym samym materiale, za pomocą tzw. polichromu Unny (mieszanina zieleni metylenowej i pyroniny) Zieleń metylenowa wykazuje powinowactwo do DNA Zieleń metylenowa wykazuje powinowactwo do DNA Pyronina swoiście wiąże się z RNA Pyronina swoiście wiąże się z RNA Efekt barwienia – czerwono zabarwione rejony komórki bogate w RNA Efekt barwienia – czerwono zabarwione rejony komórki bogate w RNA (obszary chromatyny zawierające rybosomy, jąderko), zielono-fioletowy odcień chromatyny jądrowej

28 IDENTYFIKACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH Metody fluorescencyjne – z wykorzystaniem różnych barwników fluorescencyjnych które swoiście wiążą się do DNA : Metody fluorescencyjne – z wykorzystaniem różnych barwników fluorescencyjnych które swoiście wiążą się do DNA : DAPI (dwuaminofenyloindol) DAPI (dwuaminofenyloindol) Hoechst Hoechst Hoechst Hoechst DNA w jądrze wybarwione DAPI Barwniki te przepuszczane przez błony komórkowe, wiążą się preferencyjne do rejonu par zasad adenina-tymina w DNA Barwniki te przepuszczane przez błony komórkowe, wiążą się preferencyjne do rejonu par zasad adenina-tymina w DNA

29 IDENTYFIKACJA ENZYMÓW W zawiesinie komórkowej lub hodowli można dokonać identyfikacji komórek, stosując testy na obecność enzymów specyficznych dla danych komórek, np. dehydrogenaz, reduktaz, czy oksydaz, W zawiesinie komórkowej lub hodowli można dokonać identyfikacji komórek, stosując testy na obecność enzymów specyficznych dla danych komórek, np. dehydrogenaz, reduktaz, czy oksydaz, Histochemiczne wykrywanie enzymów nie polega na identyfikacji ich jako konkretnych substancji (umożliwia to zastosowanie techniki immunohistochemicznej), lecz na uwidocznieniu produktu ich aktywności (wykrywany jest produkt reakcji histochemicznej). Histochemiczne wykrywanie enzymów nie polega na identyfikacji ich jako konkretnych substancji (umożliwia to zastosowanie techniki immunohistochemicznej), lecz na uwidocznieniu produktu ich aktywności (wykrywany jest produkt reakcji histochemicznej).

30 IDENTYFIKACJA ENZYMÓW Wykrywany enzym musi być czynny, odpowiednie procedury przygotowywania materiału. Wykrywany enzym musi być czynny, odpowiednie procedury przygotowywania materiału. Barwienie tkanki bezpośrednio po pobraniu Barwienie tkanki bezpośrednio po pobraniu Zaniechanie metod utrwalania materiału Zaniechanie metod utrwalania materiału Reakcja histochemiczna pozwalająca na wykrycie aktywności enzymu to INKUBACJA, środowisko reakcji to PŁYN INKUBACYJNY (pH, temperatura optymalna dla działania enzymu): Reakcja histochemiczna pozwalająca na wykrycie aktywności enzymu to INKUBACJA, środowisko reakcji to PŁYN INKUBACYJNY (pH, temperatura optymalna dla działania enzymu): zawiera specyficzny dla wykrywanego enzymu substrat, zawiera specyficzny dla wykrywanego enzymu substrat, jony stymulujące aktywność danego enzymu jony stymulujące aktywność danego enzymu dodatkowe składniki biorące udział w reakcji – koenzymy dodatkowe składniki biorące udział w reakcji – koenzymy

31 IDENTYFIKACJA ENZYMÓW Kilka podstawowych typów reakcji histochemicznych wykrywających aktywność enzymów Kilka podstawowych typów reakcji histochemicznych wykrywających aktywność enzymów 1. Identyfikacja hydrolaz: Reakcja precypitacji z kationami metali – reakcja Gomoriego Reakcja precypitacji z kationami metali – reakcja Gomoriego Pod wpływem enzymu obecnego w tkance dochodzi do rozszczepienia substratu, a następnie wytrąceniu rozszczepionego substratu (jonami metali Cu 2 +, Pb 2 + ) Pod wpływem enzymu obecnego w tkance dochodzi do rozszczepienia substratu, a następnie wytrąceniu rozszczepionego substratu (jonami metali Cu 2 +, Pb 2 + ) Tworzy się nierozpuszczalna sól, widoczna w mikroskopie elektronowym, do celów mikroskopii świetlnej należy przeprowadzić dodatkowo reakcje barwną Tworzy się nierozpuszczalna sól, widoczna w mikroskopie elektronowym, do celów mikroskopii świetlnej należy przeprowadzić dodatkowo reakcje barwną

32 IDENTYFIKACJA ENZYMÓW Reakcja sprzęgania do związków azotowych Reakcja sprzęgania do związków azotowych Pod wpływem obecnego w tkance enzymu dochodzi do rozszczepienie substratu (zazwyczaj jest to pochodna naftolu) Pod wpływem obecnego w tkance enzymu dochodzi do rozszczepienie substratu (zazwyczaj jest to pochodna naftolu) Dochodzi do przekształcenia pochodnej naftolu w barwny i nierozpuszczalny produkt Dochodzi do przekształcenia pochodnej naftolu w barwny i nierozpuszczalny produkt Reakcja indygogenna Reakcja indygogenna Pod wpływem obecnego w tkance enzymu dochodzi do rozszczepienie substratu (zazwyczaj jest to pochodna indoksylu) Pod wpływem obecnego w tkance enzymu dochodzi do rozszczepienie substratu (zazwyczaj jest to pochodna indoksylu) Dochodzi do utleniania substratu, produkt reakcji ma zabarwienie indygo Dochodzi do utleniania substratu, produkt reakcji ma zabarwienie indygo

33 IDENTYFIKACJA ENZYMÓW Przykłady barwienia hydrolaz ATPaza - enzym katalizujący rozpad wiązania wysokoenergetycznego w ATP, występuje m.in. w siateczce śródplazmatycznej komórek mięśni szkieletowych i wewnętrznej błonie mitochondrialnej ATPaza - enzym katalizujący rozpad wiązania wysokoenergetycznego w ATP, występuje m.in. w siateczce śródplazmatycznej komórek mięśni szkieletowych i wewnętrznej błonie mitochondrialnej

34 IDENTYFIKACJA ENZYMÓW Przykłady barwienia hydrolaz kwaśna fosfataza - występuje w dużych stężeniach w gruczole krokowym człowieka. kwaśna fosfataza - występuje w dużych stężeniach w gruczole krokowym człowieka. Aktywność jej bardzo wzrasta w Aktywność jej bardzo wzrasta w chorobie nowotworowej tego gruczołu, co wykorzystuje się w diagnostyce do wczesnego rozpoznawania tej postaci raka.

35 IDENTYFIKACJA ENZYMÓW 2. Identyfikacja dehydrogenaz. Reakcja z udziałem soli tetrazolowych Reakcja z udziałem soli tetrazolowych Sole tetrazolowe w postaci utlenionej są bezbarwne i rozpuszczalne w wodzie, w formie zredukowanej przekształcają się w formazany, produkty reakcji histochemicznej (barwne i nierozpuszczalne) Sole tetrazolowe w postaci utlenionej są bezbarwne i rozpuszczalne w wodzie, w formie zredukowanej przekształcają się w formazany, produkty reakcji histochemicznej (barwne i nierozpuszczalne) Płyn inkubacyjny – zawiera swoisty substrat (np. mleczan bursztynianu), koenzymy, sól tetrazolową Płyn inkubacyjny – zawiera swoisty substrat (np. mleczan bursztynianu), koenzymy, sól tetrazolową Wyniki: w miejscu aktywności Wyniki: w miejscu aktywności dehydrogenazy – niebiesko-purpurowe zabarwienie

36 IDENTYFIKACJA JONÓW Wykrywanie jonów żelaza ( Fe3+). Wykrywanie jonów żelaza ( Fe3+). Fragmenty tkanki inkubowano w mieszaninie z żelazocyjankiem potasu, kwasem solnym i eozyną Fragmenty tkanki inkubowano w mieszaninie z żelazocyjankiem potasu, kwasem solnym i eozyną Wyniki inkubacji: ciemny niebieski osad nierozpuszczalnych żelazocyjanków Wyniki inkubacji: ciemny niebieski osad nierozpuszczalnych żelazocyjanków Wykorzystywane w diagnostyczne chorób związanych z odkładaniem żelaza w tkankach (hemochromatozach) Wykorzystywane w diagnostyczne chorób związanych z odkładaniem żelaza w tkankach (hemochromatozach) hemochromatoza mięśnia sercowego

37 IDENTYFIKACJA PIGMENTÓW Pigmenty są barwne substancje w organizmie: Pigmenty endogenne, wytwarzane przez organizm Pigmenty endogenne, wytwarzane przez organizm endogenne barwniki krwi, hematogenne np. hemosyderyna (powstaje w wyniku rozpadu hemoglobiny, białko zawierające żelazo w formie koloidalnej, występuje w wątrobie, śledzionie, szpiku), endogenne barwniki krwi, hematogenne np. hemosyderyna (powstaje w wyniku rozpadu hemoglobiny, białko zawierające żelazo w formie koloidalnej, występuje w wątrobie, śledzionie, szpiku), inne barwniki endogenne np. melanina inne barwniki endogenne np. melanina Pigmenty egzogenne, przedostają się do organizmu z środowiska zewnętrznego Pigmenty egzogenne, przedostają się do organizmu z środowiska zewnętrznego hemosyderyna skóra człowieka, wybarwiona melanina (m.Fontana-Masson)

38 IMMUNOHISTOCHEMIA Metody immunohistochemiczne polegają na wykrywaniu i lokalizacji składników komórek i tkanek oraz substancji na zasadzie reakcji antygen- przeciwciało. Immunocytochemia – zajmuje się wykrywaniem w komórkach substancji o charakterze antygenowym Immunohistochemia – zajmuje się wykrywaniem substancji o charakterze antygenowym w tkankach Pierwsze reakcje immunohistochemiczne prowadził Coons, który wykrył antygeny przy pomocy przeciwciał znakowanych cyjankim fluoresceiny (fluorochrom), Pierwsze reakcje immunohistochemiczne prowadził Coons, który wykrył antygeny przy pomocy przeciwciał znakowanych cyjankim fluoresceiny (fluorochrom), Później fluorochromy były stopniowo zastępowane przez inne znaczniki, jak enzymy (peroksydaza), barwniki zawierające metale (ferrytyna), złoto koloidalne Później fluorochromy były stopniowo zastępowane przez inne znaczniki, jak enzymy (peroksydaza), barwniki zawierające metale (ferrytyna), złoto koloidalne

39 IMMUNOHISTOCHEMIA Założenia immunohistochemii: Każda struktura komórkowa czy tkankowa w skład której wchodzą białka (lub inne substancje zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej) ma potencjalne własności antygenowe Każda struktura komórkowa czy tkankowa w skład której wchodzą białka (lub inne substancje zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej) ma potencjalne własności antygenowe Immunohistochemiczne uwidacznianie antygenu w materiale biologicznym wymaga uzyskania go w czystej postaci, a następnie otrzymania swoistych dla tego antygenu przeciwciał Immunohistochemiczne uwidacznianie antygenu w materiale biologicznym wymaga uzyskania go w czystej postaci, a następnie otrzymania swoistych dla tego antygenu przeciwciał Wyizolowany różnego rodzaju metodami preparatyki biochemicznej antygen służy do immunizacji (pobudzenia układu immunologicznego) zwierząt laboratoryjnych, które stanowią źródło swoistych przeciwciał. Wyizolowany różnego rodzaju metodami preparatyki biochemicznej antygen służy do immunizacji (pobudzenia układu immunologicznego) zwierząt laboratoryjnych, które stanowią źródło swoistych przeciwciał.

40 IMMUNOHISTOCHEMIA Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania przeciwciała Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania przeciwciała Przeciwciała mogą być znakowane: Przeciwciała mogą być znakowane: Fluorochromami – metoda immunofluorescencji, barwniki fluorescencyjne, preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym (czerwień teksańska TR - czerwona fluorescencja) Fluorochromami – metoda immunofluorescencji, barwniki fluorescencyjne, preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym (czerwień teksańska TR - czerwona fluorescencja) Enzymami – metody immunoenzymatyczne, preparat ogląda się w mikroskopie świetlnym lub elektronowym (peroksydaza, fosfataza zasadowa) Enzymami – metody immunoenzymatyczne, preparat ogląda się w mikroskopie świetlnym lub elektronowym (peroksydaza, fosfataza zasadowa) Metalami – preparat ogląda się w mikroskopie elektronowym - ferrytyna (białko zawierające żelazo), koloidalne złoto (mikroskopijne ziarenka metalicznego złota, widoczne w mikroskopie w postaci kontrastowych czarnych punktów) Metalami – preparat ogląda się w mikroskopie elektronowym - ferrytyna (białko zawierające żelazo), koloidalne złoto (mikroskopijne ziarenka metalicznego złota, widoczne w mikroskopie w postaci kontrastowych czarnych punktów)

41 IMMUNOHISTOCHEMIA PRZEBIEG REAKCJI IMMUNOHISTOCHEMICZNEJ - MIKROSKOPIA ŚWIETLNA Reakcje immunohistochemiczną przeprowadza się na szkiełkach podstawowych lub nakrywkowych Reakcje immunohistochemiczną przeprowadza się na szkiełkach podstawowych lub nakrywkowych Blokowanie miejsc nieswoiście wiążących (inkubacja preparatów z nieaktywną immunologicznie surowicą) Blokowanie miejsc nieswoiście wiążących (inkubacja preparatów z nieaktywną immunologicznie surowicą) Inkubacja ze znakowanymi przeciwciałami w komorze wilgotnej, temp. pokojowa Inkubacja ze znakowanymi przeciwciałami w komorze wilgotnej, temp. pokojowa Wypłukanie niezwiązanych przeciwciał buforowaną solą fizjologiczną Wypłukanie niezwiązanych przeciwciał buforowaną solą fizjologiczną Dodatkowe podbarwienie skrawków (w celu skontrastowania pozostałych struktur) Dodatkowe podbarwienie skrawków (w celu skontrastowania pozostałych struktur) Zamykanie preparatu (sól fizjologiczna, glicerol, alkohol) Zamykanie preparatu (sól fizjologiczna, glicerol, alkohol)

42 IMMUNOHISTOCHEMIA PRZEBIEG REAKCJI IMMUNOHISTOCHEMICZNEJ – MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA METODA PRZED ZATOPIENIEM MATERIAŁU (preembedding) METODA PRZED ZATOPIENIEM MATERIAŁU (preembedding) Przeprowadza się na małych fragmentach tkanek lub grubych skrawkach Przeprowadza się na małych fragmentach tkanek lub grubych skrawkach Po przeprowadzeniu reakcji materiał zatapia się i kroi na ultramiktotonie Po przeprowadzeniu reakcji materiał zatapia się i kroi na ultramiktotonie Do mikroskopii elektronowej nadają się tylko skrawki z powierzchownych obszarów materiału (najbardziej intensywne wiązanie antygenu tkankowego z przeciwciałem) Do mikroskopii elektronowej nadają się tylko skrawki z powierzchownych obszarów materiału (najbardziej intensywne wiązanie antygenu tkankowego z przeciwciałem) METODA NA SKRAWKACH ULTRACIENKICH (postembedding) METODA NA SKRAWKACH ULTRACIENKICH (postembedding) Przeprowadza się po zatopieniu tkanki Przeprowadza się po zatopieniu tkanki Zatapianie metodą mrożeniową, lub żywicą akrylową (nie blokuje miejsc wiążących antygenu) Zatapianie metodą mrożeniową, lub żywicą akrylową (nie blokuje miejsc wiążących antygenu) Ultracienkie skrawki zbiera się na siatki niklowe lub złote Ultracienkie skrawki zbiera się na siatki niklowe lub złote Siatki poddaje się inkubacji w komorze wilgotnej, kładąc je na powierzchni roztworu przeciwciał Siatki poddaje się inkubacji w komorze wilgotnej, kładąc je na powierzchni roztworu przeciwciał

43 IMMUNOHISTOCHEMIA A. Neurony (czerwone) - detekcja przy użyciu przeciwciał ß-tubulin III i astrocyty (zielone) przy użyciu GFAP B. Dendrocyty (zielone) - detekcja przy pomocy markera znakowanego fluorochromem

44 IMMUNOHISTOCHEMIA Wizualizacja sieci mikrotubul w komórkach nerki. Przeciwcialo I-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 486, co umożliwia wybarwienie tubuliny, a przeciwciało II-rzędowe wyznakowane barwnikiem Alexa 546, co umożliwia wybarwienie aktyny.

45 CYTOCHEMIA Komórki hodowane in vitro stanowią bardzo dobry model do badań rozmieszczenia organelli komórkowych. Stosowane metody: Immunocytochemiczne Immunocytochemiczne Z użyciem fluorochromów (wiążą się specyficznie do błon organelii komórkowych, wyznaczają ich obecność i położenie) Z użyciem fluorochromów (wiążą się specyficznie do błon organelii komórkowych, wyznaczają ich obecność i położenie) Pierwszy obraz mikrofilamentów Pierwszy obraz mikrofilamentów w komórce uzyskał F. Wieland Barwnik rodamino-falloidyne Barwnik rodamino-falloidyne Obecnie związek ten jest komercyjnie Obecnie związek ten jest komercyjnie dostępny jako falloidyna sprzężona z izotiocyjaninem fluoresceiny.

46 HISTOLOGICZNE METODY IMPREGNACJI TKANEK Techniki impregnacji tkanek – zaawansowane metody barwienia wizualizacja komponentów komórek i tkanek niewidocznych w barwieniu przeglądowym (włókna nerwowe, komórki glejowe) wizualizacja komponentów komórek i tkanek niewidocznych w barwieniu przeglądowym (włókna nerwowe, komórki glejowe) impregnacja solami metali (srebra, złota, chromu) impregnacja solami metali (srebra, złota, chromu) metody impregnacji są bardzo pracochłonne, muszą być przestrzegane pewnych zasad np. metody impregnacji są bardzo pracochłonne, muszą być przestrzegane pewnych zasad np. nie używa się metalowych narzędzi, nie używa się metalowych narzędzi, z fragmentów tkanek muszą być dokładnie usunięte z fragmentów tkanek muszą być dokładnie usunięteutrwalacze) impregnuje się zamrożone skrawki lub bezpośrednio impregnuje się zamrożone skrawki lub bezpośrednio pobrane, które kroi się (mikrotomy) przed zamrożeniem astrocycty po impregnacji srebrem

47 POPULARNE METODY BARWIENIA W HISTOLOGII

48 BARWIENIE H+E Rutynowa metoda barwienia preparatów w histologii (szybka, prosta, uniwersalna). HEMATOKSYLINA – niebieski barwnik zasadowy (jądra komórkowe) EOZYNA – czerwony barwnik o charakterze kwasowym, (cytoplazma, włókna kolagenowe, ziarna wydzielnicze w komórkach) - czerwone Rozmaz PAP – służy do wykrywania odmian wirusa brodawczaka ludzkiego w diagnostyce raka szyjki macicy w diagnostyce raka szyjki macicy Ałunowe barwienie H&E Hematoksylina ałunowa – wybarwia Hematoksylina ałunowa – wybarwia struktury na fioletowo Miąższ płuca pacjenta z rozedmą (barwienie H-E)

49 MAY-GRUNWALD-GIEMSA Barwienie ziarnistości i substancji wewnątrzkomórkowych. Rozmazy szpiku i krwi obwodowej (utrwalone) Rozmazy szpiku i krwi obwodowej (utrwalone) Skrawki narządów (bloczki parafinowe) Skrawki narządów (bloczki parafinowe) Mieszanina barwników: barwniki anilinowe barwniki anilinowe eozyna eozyna Wynik barwienia: ciemnoniebieskie jądra ciemnoniebieskie jądra czerwone ziarnistości w eozynofilach czerwone ziarnistości w eozynofilach pomarańczowe erytrocyty i komórki nabłonkowe pomarańczowe erytrocyty i komórki nabłonkowe czerwono-fioletowa chromatyna jądrowa czerwono-fioletowa chromatyna jądrowa Rozmaz szpiku kostnego

50 BARWIENIE van GIESONA Metoda barwienie jest przydatne w diagnostyce marskości wątroby Metoda barwienie jest przydatne w diagnostyce marskości wątroby Uwidacznia pasma tkanki łącznej miedzy guzkami miąższu narządu Uwidacznia pasma tkanki łącznej miedzy guzkami miąższu narząduBarwniki: kwas pikrynowy kwas pikrynowy kwaśna fuksyna. kwaśna fuksyna. Wynik barwienia: jądra - bordowo-czarne, czarne jądra - bordowo-czarne, czarne kolagen (tkanka łączna włóknista) - różowy kolagen (tkanka łączna włóknista) - różowy mięśnie, cytoplazma - żółte. mięśnie, cytoplazma - żółte.

51 BARWIENIE GOMORIEGO Barwienie trichromem Gomoriego – metoda barwienia tkanki łącznej. metoda opisana przez George Gömöri. metoda opisana przez George Gömöri.George GömöriGeorge Gömöri w metodzie tej stosuje się hematoksylinę i roztwór zawierający chromotrop 2R i jasnozielony barwnik lub błękit anilinowy. w metodzie tej stosuje się hematoksylinę i roztwór zawierający chromotrop 2R i jasnozielony barwnik lub błękit anilinowy. włókna mięśniowe barwią się na czerwono, włókna mięśniowe barwią się na czerwono, kolagen na zielono lub niebiesko, jądra komórkowe są czarne lub niebieskie. metoda znajdująca zastosowanie metoda znajdująca zastosowanie m.in. w ocenie patologii mięśni., Preparat łożyska barwiony trichromem

52 BARWIENIE ORCEINĄ Barwienie orceiną – służy do wizulalizacji włókien elastyny koralikowaty układ włókien elastyny wybarwionych orceiną, z rozmazu guza okolicy podłopatkowej z rozmazu guza okolicy podłopatkowej

53 BARWIENIE wg MASSONA Barwienie komórek zróżnicowanych tkanki łącznej, szeroko stosowane w histologii, Barwienie komórek zróżnicowanych tkanki łącznej, szeroko stosowane w histologii, metoda trójbarwna (struktury barwią się odmiennymi barwnikami) uzyskując zróżnicowany obraz cytologiczny metoda trójbarwna (struktury barwią się odmiennymi barwnikami) uzyskując zróżnicowany obraz cytologiczny Barwnik: trichrom Massona Hematoksylina, kwaśna fuksyna, błękit anilinowy Hematoksylina, kwaśna fuksyna, błękit anilinowy Wynik barwienia: jądra – kolor czarny jądra – kolor czarny cytoplazma – kolor czerwony cytoplazma – kolor czerwony włókna kolagenowe, substancje śluzowate – kolor niebieski włókna kolagenowe, substancje śluzowate – kolor niebieski Barwnik: zielony trichrom Massona Hematoksylina, kwaśna fuksyna, green SF Hematoksylina, kwaśna fuksyna, green SF Wynik barwienia: jądra- kolor niebieski na czarny jądra- kolor niebieski na czarny mięśnie - kolor czerwony mięśnie - kolor czerwony kolagen - kolor zielony kolagen - kolor zielony

54 BARWIENIE wg MALLORYE’GO Barwienie stosowane w różnicowaniu tkanki mięśniowej, łącznej, różnicowaniu komórek w nerce. Barwnik: Fuksyna kwaśna Fuksyna kwaśna Barwnik Malloryego: błękit anilinowy, oranż G Barwnik Malloryego: błękit anilinowy, oranż G Wynik barwienia: jądra – kolor czerwony jądra – kolor czerwony cytoplazma – różowo-czerwona cytoplazma – różowo-czerwona włókna kolagenowe – kolor niebieski włókna kolagenowe – kolor niebieski mięśnie - pomarańczowoczerwone mięśnie - pomarańczowoczerwone

55 BARWIENIE HISTOCHEMICZNE W MIKROBIOLOGII BARWIENIE GRAMMA Standardowa metoda barwienie bakterii Standardowa metoda barwienie bakterii Pozwala doświadczalnie zróżnicować bakterie na dwie duże grupy (Gram+ i Gram-) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, różnice w fizjologii i podatności na leki. Pozwala doświadczalnie zróżnicować bakterie na dwie duże grupy (Gram+ i Gram-) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej oraz, różnice w fizjologii i podatności na leki.Gram+Gram-Gram+Gram- Barwienie pozwalające wykryć różne mikroorganizmy w tkankach. Barwienie pozwalające wykryć różne mikroorganizmy w tkankach.

56 BARWIENIENIE HISTOCHEMICZNE W MIKROBIOLOGII BARWIENIE ZIEHLA-NEELSENA barwienie różnicujące opisane przez lekarza bakteriologii Franza Ziehl Neelsena barwienie różnicujące opisane przez lekarza bakteriologii Franza Ziehl Neelsena służy do identyfikacji kwasoopornych organizmów, w szczególności z rodzaju Mycobacterium służy do identyfikacji kwasoopornych organizmów, w szczególności z rodzaju Mycobacterium Barwnik: Barwnik: fuksyna, fuksyna, błękit metylenowy błękit metylenowy Wynik barwienia: Wynik barwienia: bakterie kwasooporne – bakterie kwasooporne – kolor czerwony (fuksyna) bakterie niekowasooporne – bakterie niekowasooporne – kolor niebieski (błekit metylenowy) Mycobacterium tuberculosis

57 Dziękuję za uwagę


Pobierz ppt "METODY HISTOCHEMICZNE - przygotowanie, metody barwienia, określenie wewnątrzkomórkowych enzymów w tkance mgr Małgorzata Semik Politechnika Rzeszowska."

Podobne prezentacje


Reklamy Google